타겟 검증을 위해 CD14+ 단핵구를 분리하는 것이 왜 중요한가요?

CD14+ 단핵구를 분리함으로써 IL-10 분비 및 T 세포 억제를 담당하는 MSC 유도 면역 조절 세포군을 직접 평가할 수 있으며, 이는 기전적 표적 검증을 지원합니다.

CFSE 희석이 이 분석에서 종속 변수를 어떻게 정량화합니까?

CFSE 희석은 분열 과정에서 형광 감소를 추적하여 T 세포 증식을 측정하며, 공동 배양 실험에서 억제 정도를 종속 변수로 하여 정량적인 판독값을 제공합니다.

팀 간 분석의 신뢰성을 보장하기 위해 어떤 반복 실험이 필요한가요?

재현성을 위해서는 분석자와 기관에 관계없이 재현 가능한 억제 수치를 생성할 수 있도록 MSC-PBMC 공배양 기간, 단핵구 분리 효율 및 T 세포 활성화 조건이 일정하게 유지되어야 합니다.

단핵구 농도의 영향을 해석하기 위해 어떤 통계 분석이 필요한가요?

단핵구 농도를 증가시켜 용량-반응 분석을 수행하면 T 세포 증식 억제 정도를 통계적으로 비교할 수 있어, 면역 조절 효능의 정량적 평가가 가능합니다.

이 분석법은 발견 파이프라인의 어느 단계에서 수행해야 합니까?

이 분석은 MSC 표적 확인 후에 적용하여, 리드 최적화 또는 전임상 효능 연구로 넘어가기 전 단핵구 매개 면역 조절 기전을 검증해야 합니다.

백혈구 증식에 대한 단핵구의 면역조절 효과를 평가하기 위한 체외 분석

JoVE Encyclopedia of Experiments

면역학

0 조회수 • 2:46 분 • July 8th, 2025

부착성 중간엽 줄기 세포(MSC) 배양액이 있는 멀티웰 플레이트를 가져갑니다.

말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMC를 추가하고 배양합니다.

중간엽 줄기세포는 간세포 성장 인자를 분비하여 단핵구가 면역 조절 표현형을 획득하도록 유도하여 인터루킨-10 또는 IL-10을 생성합니다.

PBMC 함유 상청액을 튜브로 옮깁니다.

단핵구 표면 마커 CD14에 결합하는 항체 코팅 마그네틱 비드를 추가합니다.

자기 분리기를 사용하여 CD14+ 단핵구를 분리하고 농도를 증가시켜 멀티웰 플레이트 웰에 추가합니다.

형광 염료 CFSE 표지 이펙터 CD4+ T 세포를 도입합니다.

T 세포 표면 마커 CD3 및 CD28에 특이적으로 결합하는 항체 접합 마이크로비드를 추가하여 세포를 활성화합니다.

단

핵구가 잘 부족한 대조군에서는 활성화된 T 세포가 증식하고 각 세포 분열은 딸 세포에서 CFSE 형광 강도를 감소시킵니다.

그러나 공동 배양에서 MSC 유도 단핵구는 IL-10을 분비하여 이펙터 T 세포 증식을 억제합니다.

유세포 분석을 사용하여 단핵구 농도가 증가함에 따라 감소된 CFSE 형광 강도를 나타내는 T 세포가 더 적은 수를 관찰하여 MSC 유도 단핵구에 의한 이펙터 T 세포 증식의 억제를 나타냅니다.

이펙터 억제 분석을 수행하려면 2.5 x 10⁶ PBMC와 MSC-PBMC 공동 배양을 설정하여 250,000 MSC와 공동 배양하여 하위 집단 선택을 위한 충분한 MSC 공동 배양 PBMC를 보장합니다.

섭씨 37도에서 48-72시간 후, 적절한 마그네틱 비드로 MSC 유도 면역조절 백혈구를 선택합니다. 그런 다음 CFSE 표지된 동종 CD4 양성 T 세포를 웰당 1밀리리터의 완전 백혈구 배지에 다양한 실험 비율로 첨가합니다.

다음으로, CD4 양성 T 세포를 자극하기 위해 1:1 비드 대 세포 비율로 항-CD3/28 접합 마이크로비드를 추가합니다. 공동 배양 3일째에 유세포 분석법으로 CFSE 표지 CD4 양성 T 세포의 증식을 평가합니다.