Name: IgY 기술 : 폴리에틸렌 글리콜의 노른자위에서 치킨 항체의 추출 (PEG) 강수량 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 배우세요 폴리에틸렌 글리콜 강수법을 이용한 계란 노른자에서 IgY 항체 추출 방법입니다. 이 프로토콜은 면역학 연구에 활용 가능한 항체를 효율적으로 분리하여 제공합니다.

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이 작품은 교육과 연구의 독일 연방 교육부에서 교부금에 의해 지원되었다 (프로젝트 BiGRUDI [동성 ologische G efahrenlagen : R isikobewertung, U ltraschnelle D etektion 깨물어 I dentifizierung 폰 bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). 우리는 우수 기술 지원 B. Diemar을 (샤히떼 - Universitätsmedizin 베를린, 인스티투트 FÜR Pharmakologie) 감사합니다.

1. 프로토콜 - PEG - 강수량에 의해 IgY - 추출 그림. 1 IgY - 적출 수술의 구조 다이어그램을 (표 2 참조) 있습니다. 프로토콜이 처음 폴손 외에 설명되어되었습니다. 1980. 모든 단계 라텍스 장갑을 사용하여 수행되어야합니다. <ol><li> 달걀 껍질은 신중하게 금이되고 노른자는 가능한 한 많은 흰 계란으로 제거하기 위해 '노른자 스푼 "으로 전송됩니다. </li><li> 난황이 필터 종이로 전송하고 나머지 흰자위를 제거하는 압연입니다 노른자 피부는 첨두 또는 이와 유사한 악기 (피펫 팁)으로자를 수 있습니다. 난황은 50 ML 관에 부어 있으며, 계란 볼륨 (V1) 등록되어 있습니다. </li><li> 두 번 PBS의 계란 노른자 볼륨이 전체 볼륨의 노른자 (ΣV1 + V2), 이후 3.5 %의 PEG 6000 (g에 박살 나자)와 혼합이 추가되고 vortexed 10 분 롤링 믹서에서 굴러옵니다. 추출 절차의 단계는 두 단계의 현탁액을 분리합니다. 한 단계는 "노른자의 고체 및 지방산 물질"(폴손 외의 원래 견적. 1980)과 IgY 및 기타 단백질을 포함하는 물의 단계로 구성되어 있습니다. </li><li> 튜브는 4 centrifuged 아르 ° 20 분 (10,000 RPM 13,000 XG, Heraeus Multifuge 3SR + 고정 앵글 로터에 따라)를위한 C. 뜨는 (V3)이 접혀 필터를 통해 부어 새로운 튜브로 전송됩니다. </li><li> g (새 볼륨에 따라 계산)에 8.5 %의 PEG 6000은 튜브에 추가 vortexed과 스텝 3에서와 같이 회전 믹서에 압연 있습니다. </li><li> 뜨는이 삭제되는 차이와 4 단계를 반복합니다. </li><li> 펠렛은 신중하게 유리 막대와 vortexer에 의해 한 ML PBS에 용해됩니다. PBS 10 ML의 최종 볼륨 (V4)에 추가됩니다. 솔루션은 12 % PEG 6000 (W / V, 1.2 g)과 혼합하여 3 단계 (와동, 압연 믹서)와 같이 취급됩니다. </li><li> 6 단계를 반복하여 800 μl PBS에 신중 펠렛을 (유리 막대와 와동) 디졸브. 사라지고 다음 투석 캡슐을 (피펫) 추출을 전송하기 위해 공기 방울 나올 때까지 기다리는 것이 좋습니다. 400 μl PBS로 튜브를 씻어 투석 장치 (V5)에 볼륨을 추가합니다. (투석 장치와 점막의 준비에 대한 부록을 참조하십시오.) </li><li> 추출물은 0.1 %의 염분 (1,600 ML)에서 밤새도록 dialysed 부드럽게 자기 활동가에 의해 흔들 수 있습니다. 다음 아침, 호수는 PBS로 대체하여 다른 세 시간 동안 dialysed입니다. </li><li> 이후 IgY - 추출물은 피펫으로 투석 캡슐에서 가져온 및 2ml 튜브로 전송됩니다. 최종 볼륨은 2 ML (V6) 주변이다. </li><li> 샘플의 단백질 함량 (MG / ML)을 (그림을 참조하십시오. 2) 280 NM (PBS에 희석 1시 50분)에 photometrically 측정과 IgY에 대한 1.33의 흡광 계수와 램버트 - 비어 법칙에 따라 계산, 그림 . 4 준비의 품질 (순도 및 복구가 80 % 정도된다)를 보여줍니다. </li><li> 그것은 ° C (-70 ° C에서 샘플을 동결하지 않음) -20에서 aliquots에 샘플을 저장하는 것이 좋습니다. </li><li> 최종 준비의 품질로 조브 프로토콜에 설명된 간단한 SDS - PAGE로 분석됩니다 <a href="https://www.jove.com/details.php?id=1916">https://www.jove.com/details.php?id=1916</a> </li></ol> 2. 부록 - 전에 투석 가방이 제조 업체의 권장 사항에 따라 다음과 같은 방법으로 준비를해야합니다 사용 : <ol><li> 20 투석 가방은 30cm의 조각으로 절단하고 2000 ML 유리 비커에 부여됩니다. </li><li> 5 MM - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션의 1750 ML이 추가됩니다. </li><li> 유리 깔때기는 가방은 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션이 적용되는 것을 보장하기 위해 가방 위에 배치됩니다. 솔루션은 온수와 5 분 (철판)에 삶은입니다. 솔루션은 decanted되고 가방은 증류수로 세 번 씻어 있습니다. </li><li> 다시 한번 1750 ML - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션은 추가 5 분 삶은 이상과 같은 증류수로 세 번 씻어 있습니다. </li><li> 마지막으로 투석 가방은 증류수에서 10 분 끓인 4에 저장됩니다 ° C. 멸균 핀셋 통해 투석 가방을 가져가라. </li></ol> 3. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 폴손 외의 원래 설명에 따라 폴리에틸렌 글리콜 석출에 의해 IgY - 추출의 도식 다이어그램. 1980. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig1.jpg">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 시대의 의존에서 예방 접종을 암탉의 계란 노른자에서 총 - IgY 개발. 총 IgY / 계란 및 SD (N = 4 누워있는 암탉)의 주간 의미는 주어진. [폴리 외. 2009]에서). <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. Layi다른 항원과 예방 접종을 사 암탉의 NG 용량 모니터링. 화살표는 예방 접종 날짜를 ([폴리 외. 2009]에서)을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig3.jpg">여기 큰 이미지를 클릭 볼 수 있습니다.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 조건을 감소에 따라 다른 계란에서 개별 IgY의 준비 Polyacrylamide - Gelelectrophoresis 레인 1 - 분자량 마커, 레인 2 - IgY 표준, 레인 3-5 - 프로토콜에서 설명한대로 다른 IgY 샘플 준비. 이것은 프로토콜의 10 단계에 따라 최종 준비하고 있습니다. HC - 무거운 체인, LC - 라이트 chaines? - 35 KDA (아마도 vitellogenin II 전구체의 C - 말단 조각, [. Klimentzou 외, 2006]) 주변의 분자량에 해당하는 경미한 불순물. <table border="1"><tbody><tr><td> </td><td> 치킨 21 (항원) </td><td> 치킨 22 일 (항원) </td><td> 치킨 19 일 (항원 B) </td><td> 치킨 23 조 (항원 C) </td></tr><tr><td> 에그 번호 (총 IgY) 1, 2 년 기간 </td><td> 625 (38 G) </td><td> 626 (38 G) </td><td> 545 (33 G) </td><td> 608 (37 G) </td></tr><tr><td> 에그 번호 (총 IgY), 첫해 </td><td> 345 (20 G) </td><td> 304 (16g) </td><td> 326 (18 G) </td><td> 308 (17 G) </td></tr><tr><td> 에그 번호 (총 IgY), 두번째 년 </td><td> 280 (18 G) </td><td> 322 (21 G) </td><td> 219 (15 G) </td><td> 300 (20g) </td></tr><tr><td> 최대의 %. 가능한 계란 번호 (첫 해에) 2 </td><td> 106 </td><td> 93 </td><td> 100 </td><td> 95 </td></tr><tr><td> 최대의 %. 가능한 계란 번호 (두 번째 년) </td><td> 86 </td><td> 99 </td><td> 67 </td><td> 92 </td></tr><tr><td> 가공 계란의 수를 </td><td> 565 </td><td> 620 </td><td> 283 </td><td> 401 </td></tr></tbody></table> 총 IgY 1 금액은 그림 2의 데이터에 따라 계란 60 MG 단백질의 의미 값으로 달걀의 개수를 곱하여 계산됩니다. 2 최대. 연간 가능한 달걀 번호는 개종의 정보에 따라 325입니다. 표 1. 다른 항원과 예방 접종을 닭이 계란 누워있는 용량을 2 년 통계. (그림도 참조하십시오. 3) 2 년 동안 서로 다른 항원뿐만 아니라 IgY - 결과와 예방 접종 후 네 암탉의 최대 비율의 용량을 누워, [폴리 외. 2009]). <table border="1"><tbody><tr><td> 에그 넘버. </td><td> 헨 넘버. 날짜 누워 </td><td> V1 [ML] 난황 </td><td> V2 [ML] PBS </td><td> 1. PEG prec. [G] </td><td> 권 [ML] 후 </td><td> 2. PEG prec. [G] </td><td> 작은 공 </td><td> 3. PEG prec. [G] </td><td> 작은 공 </td><td> 권 [ML] </td><td> 총 단백질 MG / ML </td><td> 수정된 총 단백질 MG / ML </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2xV1 ΣV1가 + V2 </td><td> 3,5 % [W / V] ΣV1 + V2 </td><td> prec., centrif. 및 여과 V3 </td><td> 8,5 % [W / V] V3 </td><td> V4 ML PBS에 용해 </td><td> 12% [W / V] V4 </td><td> ML PBS V5에 녹아있는 </td><td> PBS V6에 대한 투석 후 </td><td> A280/ml </td><td> A280/ml : 1.33 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> H293 / 22.10. </td><td> 15 </td><td> 30 45 </td><td> 1.58 </td><td> 31 </td><td> 2.63 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.7 </td><td> 35.0 </td><td> 26.3 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> H293 / 23.10. </td><td> 13 </td><td> 26 39 </td><td> 1.37 </td><td> 25 </td><td> 2.12 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.7 </td><td> 28.8 </td><td> 21.6 </td></tr></tbody></table> 표 2. PEG 침전의 전형적인 프로토콜

<ol><li>Akita, E. M., Nakai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+purification+methods+for+the+production+of+immunoglobulins+from+eggs+laid+by+hens+immunized+with+an+enterotoxigenic+E.+coli+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain.</a> J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).</li>
<li>De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Agricult.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review.</a> Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).</li>
<li>Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h, Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly%2C+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27, 183-193 (2006).</li>
<li>Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+laying+capacity%2C+immunoglobulin+Y+concentration%2C+and+antibody+titer+development+in+chickens+immunized+with+ricin+and+botulinum+toxins+over+a+two-year+period%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period.</a> Poultry Science. 88, 281-290 (2009).</li>
<li>Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+viral+IgY+antibodies+from+yolks+of+immunized+hens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Commun%22%5BJournal%5D)">Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens.</a> Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).</li>
<li>Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchade%2C+R+%22Chicken+egg+yolk+antibodies%2C+production+and+application+%3A+IgY-Technology%22">Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology</a>. , Springer. Berlin. (2001).</li>
<li>Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+egg+yolk+antibodies+%28IgY-technology%29%3A+a+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Altern.+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).</li>
<li>Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun-supported+DNA+immunisation+of+chicken+for+straightforward+production+of+poxvirus-specifiv+IgY+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).</li>
</ol>

동물 실험 Landesamt 모피 아퍼 놀이 Soziales 베를린 (H 0069/03)에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

적당한 IgY 정화 방법의 선택은 정화 (연구소 또는 산업), 비용 효율성, 기술 (실험실 장비)와 환경 (폐기물 관리)에 영향을 미치는 규모에 의해 영향을받습니다. 다양한 IgY 추출 방법은 데 Meulenaer &amp; Huyghebaert (2001, 검토도 쉐이드 외를 참조하십시오. 2005)에 의해 상세하게 검토했다. 일반적으로 이러한 방법의 세 주요 그룹으로 나눌 수 있습니다 : <ol><li> 강수량 방법 : 암모니아 또는 나트륨 황산염, polyethyleneglycol (PEG), caprylic 산성 및 caragenean를 포함. </li><li> 색층 방법 : 친화도 크로마 토그래피, 이온 교환 크로마 토그래피, 소수성 상호 작용 크로마 토그래피, thiophylic 상호 작용 크로마 토그래피 및 겔 - 여과 크로마 토그래피. </li><li> Ultrafiltration. </li></ol> IgY 준비 순도는 방법의 조합에 의해 증가시킬 수 있으며, 예를 들어, PEG 강수량은 친화도 크로마 토그래피와 함께하실 수 있습니다. 어떤 경우에는 최종 응용 프로그램에 따라 IgY의 물 추출물은 좋은 결과를 (아키타 &amp; 나카이 1993) 달성을 충분합니다. 우리의 경험에 따르면, 우리는 PEG - 석출에 의해 얻을 IgY - 샘플은 다양한 면역 assays 많은 매우 잘했습니다. PEG - 석출 방법을 표준화하여 한 기술 비서가 4 7g 주당 사이에 총 IgY의 금액에 해당하는 약 84 알을 주당을 처리할 수 있습니다. 단순 계산 : 누워있는 암탉은 항원과 예방 접종을합니다. 몇 부스트 예방 접종 후 암탉 30 일 기간 동안 1:50,000의 titre로 특정 항체 (AB)를 생산하고 있습니다. 30 달걀 X 2 ML IgY 추출물 (프로토콜과 그림. 3 참조) 3,000리터와 의미 차례로 3,000리터의 AB - 희석 (통의 용량이 10리터입니다)에 해당하는 60 ML 총 IgY, 해당 AB 솔루션 300 버킷이 채워져 수 있습니다. 그래서, 같은 거대한 AB - 수량의보기에 그것은 지속적인 품질과 특이성의 AB - 수영장 저장 아무런 문제가 없습니다. 이 기술은 별도 polyspecific AB에서 관찰 충전 / 많은 변화를 줄여줍니다. 포유류의 보완 시스템의 아니오 활성화, 하마 (인간의 안티 마우스 항체), 류마티스 요인이나 인간의 피를 그룹 항원 (heteroagglutinins 부족)와 노 교차 반응성 : 수량의 측면의에도 불구하고, IgY AB는 포유류의 IgG에 비해 더 장점이있다. IgY - AB의 뛰어난 장점은 소위 phylogenetic 거리입니다. Phylogenetic 거리가 동일하게 예방 접종을 때에도, 포유류와 닭의 순이 specificities 사이에 자주 설명한 차이에 대한 이유입니다. 포유 동물과 조류 자신의 면역 시스템 사이의 차이 이외에,이 두 동물 수업 phylogenetic 개발의 차이는 서로 다른 순이 specificities에 기여하고 있습니다. 몇몇 저자는 닭은 종종 더 효율적으로 토끼 (검토 쉐이드 동부 표준시 A. 2005 참조)보다 phylogenetically 고도 보존 포유 동물 단백질이나 펩티드에 대한 애비를 만들어보고있다. 그 결과, 보존 항원은 토끼 면역 체계에 &quot;가면을 쓴&quot;남아 있으므로에서만 약한 또는 &quot;자동&quot;응답을 일으킬 수 있습니다. 병아리와 토끼가 같은 포유류의 항원과 예방 접종을하는 경우뿐만 아니라, 매우 자주 닭이 거의 토끼에서 얻을 수 없습니다 AB - 특이성과 반응한다. AB는 난황에서 추출한 비 invasively 있기 때문에 또한 동물 복지의 측면이 중요합니다. 조합의 유전자 군 (플라스미드) 예방 접종과 IgY 생산은 (Witkowski 외. 2009) 완전히 비침습입니다. 결론적으로, 암탉과 PEG - 석출에 의해 IgY - 추출에서 AB의 생산은 매우 비용 효과적인 최대 1:1,000,000으로 안정 titres와 매우 구체적인 AB 결과. 에이브스와 포유류 사이 phylogenetic 거리로 인해, 닭고기 예 토끼와는 대조적으로 매우 보존 포유류의 항원에 대한 구체적인 AB 생산 수 있습니다. IgY 기술 얻은 AB의 특별한 금액은 치료 / 예방 목적으로 인간 및 동물용 의약품의 IgY - AB를 사용에도 문을 엽니다.

<ol><li> -14 KD, 칼 로스 GmbH를, 카를 스루에, 독일 잘라 가방 Visking, 유형 32분의 27을 Dialyse </li><li> 팔콘 튜브 블루 맥스 50 ML 폴리 프로필렌 코니컬 튜브, 백톤 디킨슨 Labware, 프랭클린 레이크스 NY, 미국 </li><li> 접힌 필터 MN 615 ¼, ∅ 150mm, 칼 로스 GmbH를, 카를 스루에, 독일 Heraeus </li><li> 자기 활동가, Variomag 모노, H + P Labortechnik AG, Oberschleißheim, 독일 </li><li> 마이크로 Dialyse - 캡슐 5,0 ML, 칼 로스 GmbH를, 카를 스루에, 독일 </li><li> Multifuge 3SR +, 써모 과학, Langenselbold, 독일 </li><li> 광도계 UV - 160A, Shimadzu 독일 GmbH를, 뒤스부르크, 독일 </li><li> 폴리에틸렌 글리콜 6000, Rotipuran 박사 유로., 칼 로스 GmbH를, 카를 스루에, 독일 </li><li> Premixed PBS - 버퍼 10X, 로체 진단 GmbH를, 만하임, 독일 </li><li> 롤러 믹서 SRT2, 스튜어트, 스태포드셔, 영국 </li><li> Vibrofix VF2, 장케 &amp; 쿤켈, 이카 - Labortechnik, Staufen i.Br., 독일 </li><li> 난황 스푼, Fackelmann (houshold 효과), 독일 </li></ol>

igy 기술 : 폴리에틸렌 글리콜의 노른자위에서 치킨 항체의 추출 (peg) 강수량

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

암탉은 메신저 예방 접종 (Musculus pectoralis, 왼쪽 및 오른쪽, 사출 볼륨 0.5-1.0 ML)를 통해 또는 유전자 건 플라스미드 - 예방 접종에 의해 예방 접종을하실 수 있습니다. 항원의 immunogenicity에 따라, 높은 항체 - titres은 (최대 1:100,000 - 1:1,000,000) 하나 또는 3 이후 얻을 수 - 4 부스트 예방 접종을. 일반적으로, 암탉은 이후 누워 용량 감소에 대한 72주 끊임없이 알을 낳는. 이 프로토콜은 침전 절차 수단 (PEG. 폴손 외. 1980)로 달걀 노른자에서 총 IgY의 추출을 설명합니다. 방법은 두 가지 중요한 단계를 포함한다. 첫번째는 lipids의 제거이고 두 번째 단계 중 하나 뜨는에서 총 IgY의 강수량입니다. 버퍼 (일반적으로 PBS)에 대한 투석 후 IgY - 추출물은 년 이상 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. 추출물의 순도는 80 % 근처이고, 계란 당 총 IgY가 누워있는 암탉의 연령에 따라, 40-80 MG에서 다릅니다. 최대 80 MG / 계란 (PEG 침전에 관한)에 40 MG / 계란에서 암탉의 나이가 총 IgY 콘텐츠 증가합니다. 연간 암탉의 누워있는 용량은 325 계란 주위에있다. 60 MG 총 IgY / 계란 (표 1 참조)의 의미 IgY의 콘텐츠를 기반으로 20g 총 IgY / 올해의 총 잠재 수확을 의미합니다.

이 프로토콜은 폴리에틸렌 글리콜 석출에 의해 난황에서 총 IgY의 특정 추출에 대해 설명하고 IgY 기술에 대한 일반적인 정보를 제공합니다.

IgY 기술 : 폴리에틸렌 글리콜의 노른자위에서 치킨 항체의 추출 (PEG) 강수량

암탉은 근육 내(i.m.) 백신 접종(좌우 대흉근, 주입량 0.5-1.0ml) 또는 유전자 총(Gene-Gun)을 통해 면역화할 수 있습니다...

이 영상에서는 유전자 gum, 플라스미드 또는 더 전통적인 방식인 근육 내 주사법으로 면역화할 수 있는 암탉으로부터 IGY 항체를 분리하는 과정을 보여줍니다. 먼저 난황을 분리합니다. 그 다음 지질을 침전시키고, 이어서 항체가 포함된 단백질 분획을 침전시킨 후 추가적인 침전 단계에서 항체를 분리합니다.마지막으로, 항체를 PBS에 대해 투석합니다.네. 안녕하세요. 제 이름은 Ard입니다. 이쪽은 제 동료인 Adema이며, 저희는 베를린 샤리테 의과대학 소속의 매우 오래되고 유명한 약리학 연구소에서 근무하고 있습니다.이어서 닭달걀 요거트로부터 IGY를 추출하는 방법을 보여드리고자 하며, 이는 매우 간단하면서도 매우 비용 효율적인 방법이라고 생각됩니다. 그리고 이 모든 과정은 소위 IGY 기술에 속합니다. IGY 준비의 첫 번째 단계는 난황을 분리하는 것입니다.이 절차를 위해 튜브 랙, 블루 캡 필터 팁, 피펫 팁 버퍼, 유리 비커, 노른자를 흰자로부터 분리하기 위한 스푼, 그리고 당연히 달걀이 필요합니다. 달걀을 노른자 스푼 위에서 깨뜨려 흰자를 배출시킵니다. 그런 다음 달걀이 담긴 노른자 스푼을 가볍게 흔들어 대부분의 흰자를 제거합니다.그 후 난황을 거름종이로 옮겨 난백 단백질을 최대한 완전히 제거합니다. 보관 기간이 3개월을 넘지 않은 1개월 이내의 신선한 계란의 경우 난황막은 매우 안정적입니다. 거름종이 위에서 굴리는 과정 중 노화 과정으로 인해 난황막이 파열될 수 있습니다.그 후, 피펫 팁으로 난황막을 절개하여 튜브로 옮깁니다. 마지막으로 확인하면 난황의 부피가 약 15 milliliters 정도임을 알 수 있습니다. 이 부피는 성숙한 산란계의 정상 범위이며 편차가 매우 적습니다.난황의 부피를 기록합니다. IGY를 포함한 난황 단백질을 난황 내 지질로부터 분리하기 위해 PBS 완충액 내에 침전제로 3.5% Polyethylene glycol을 사용합니다. 최종 난황 및 완충액 부피의 3.5%에 해당하는 Polyethylene glycol 1.58 g을 전자저울로 정밀하게 측정합니다. 15 mL의 난황을 2배 부피의 PBS 완충액과 혼합하므로, PBS 30 mL를 첨가하여 최종 부피를 45 mL로 맞춥니다. 그 다음, 혼합물에 Polyethylene glycol을 첨가합니다.튜브의 캡을 닫고 20~30초 동안 충분히 볼텍싱합니다. 주기적으로 튜브를 뒤집어 줍니다. 볼텍싱 과정 동안에 수행합니다.볼텍싱 후, 난황이 완전히 부유 상태가 되어야 합니다. 이제 튜브를 롤러 믹서에 10분 동안 둡니다. 그 결과, 색상이 노란색에서 연노란색으로 변하며 균일한 혼합물이 됩니다.이제 혼합물을 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리를 통해 IGY와 기타 단백질을 포함하는 투명한 상층액과 주로 지질로 구성된 노란색 침전물이 분리됩니다. 다음 단계에서, 상층액을 접은 필터에 걸러 새 튜브로 옮깁니다.새로운 부피를 기록하고 침전물은 버립니다. 이제 다시 한번, 상층액에 polyethylene glycol을 최종 농도 12%가 되도록 첨가합니다. 이는 1차 침전 시의 3.5%에 결과물인 SNAT 부피의 8.5%를 더해 12%가 됨을 의미합니다. 그 후, 용액을 이전과 같이 롤러 믹서에서 교반 및 배양하고 20분 동안 원심 분리합니다. 이제 polyethylene glycol이 IGY 및 다른 단백질들을 침전시킵니다.이 원심분리 단계 후, 펠릿을 용해 준비에 사용합니다. 펠릿 유리 막대를 70% ethanol로 소독하고 막대가 마르는 동안 S 상청액은 폐기합니다. 그런 다음 튜브를 뒤집어 남은 상청액을 모두 제거합니다.그 다음 펠릿에 1 mL의 PBS를 첨가합니다. 유리 막대를 사용하여 펠릿을 녹이면서 충분히 볼텍싱합니다. 그러면 연한 노란색 용액이 나타납니다.이제 최종 부피가 10 milliliters가 되도록 PBS를 첨가한 후, 두 번째 원심분리와는 달리 이전과 동일하게 12% 농도로 세 번째 polyethylene glycol 침전을 수행합니다. 이번에는 20분 동안 원심분리하면 흰색 침전물이 생성됩니다. 펠릿은 이전과 동일한 방식으로 용해시키되, 두 단계에 걸쳐 진행합니다.첫 번째 단계에서는, 이를 0.8 milliliters의 PBS에 녹여 마이크로투석 캡슐로 옮깁니다. 그다음 튜브를 추가로 0.4 milliliters의 PBS로 헹구고, 이 세척액 또한 캡슐로 옮깁니다. 다음 단계에서는, 소독된 가위로 투석 백을 자르고 증류수로 헹굽니다.그다음 투석 막을 캡슐의 하단부에 놓고 상단부로 단단히 밀봉합니다. 마지막으로, 캡슐들을 마그네틱 교반기 위에 놓인 유리 비커로 옮깁니다. IGY 용액을 0.1% saline에 대해 하룻밤 동안 투석합니다.다음 날, IGY 용액을 PBS에 대해 3시간 동안 투석합니다. 투석이 끝나면 피펫 팁으로 투석막에 구멍을 뚫고 IGY 용액을 꺼내 작은 튜브로 옮깁니다. 최종 부피를 기록합니다.최종 생성물은 투명한 용액이며, -20 °C에서 수년 동안 보관할 수 있습니다. 저희의 경험에 따르면, -70 °C에서는 활성이 현저히 감소하는 것이 관찰되었으므로 IGY 조제물을 -70 °C에서 보관하지 마십시오. 저희 프로토콜을 따르면 IGY 추출이 매우 간단하고 효과적인 절차라는 점이 충분히 전달되었기를 바랍니다.필요한 장비가 최소한으로 구성되어 있어, 투입되는 노력 대비 얻을 수 있는 이점이 충분하다고 생각합니다. 제가 그러했듯이, 이 비디오 출판물이 여러분이 저희의 프로토콜과 기술을 유용하게 활용하는 계기가 되기를 바랍니다. 감사합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

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