EPS Matrix Detection을 통한 담즙염 유도 생물막 형성을 연구하기 위한 분석

성장 배지에 병원성 장내 박테리아가 들어 있는 멀티웰 플레이트를 취하십시오.

선택된 우물의 배지에는 가혹한 성장 조건을 모방하는 담즙염 또는 세제와 같은 활성을 가진 양친성 분자가 포함되어 있습니다.

담즙염은 박테리아 막을 파괴하고 DNA와 단백질에 손상을 일으킵니다.

대항 메커니즘으로 박테리아는 생물막(생물막)을 형성합니다 — 미생물 기원의 다당류, 단백질, 지질 및 핵산을 포함하는 세포외 고분자 물질(EPS)의 자체 생산 매트릭스에 둘러싸인 구조화된 박테리아 군집입니다.

EPS 층은 박테리아가 담즙염에 노출되지 않도록 보호합니다.

배양 후 배지를 흡인하여 자유롭게 떠다니는 박테리아를 제거합니다.

생물막의 구조를 보존하기 위해 고정 완충액으로 처리하고 과도한 완충액을 제거하기 위해 세척합니다.

형광 표지된 Concanavalin A(EPS 다당류에 결합하여 생물막을 표지하는 렉틴)를 추가합니다. 과도한 Concanavalin A를 제거하기 위해 세척하십시오.

플레이트 리더를 사용하여 형광을 측정합니다. 담즙염 함유 우물에서 더 높은 형광 강도는 담즙염 유도 생물막 형성을 나타냅니다.

EPS의 반정량적 검출을 위해 다중 채널 피펫을 사용하여 배양 배지를 투명한 96웰 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 200마이크로리터의 고정 시약을 사용하여 실온에서 15분 동안 검은색 플레이트를 고정합니다. 이제 표준화를 위해 컨트롤을 블랭크로 설정하여 OD600 판독값을 기록합니다. 그런 다음 부착 인구가 고정되는 동안 배양 배지의 판독값을 기록합니다.

고정이 완료되면 시약을 제거하고 유해 폐기물에 버리십시오. 그런 다음 200마이크로리터의 멸균 PBS를 사용하여 웰을 부드럽게 두 번 세척합니다. 세척 후 PBS를 흡인합니다. 다음으로, ConA-FITC 밀리리터당 25마이크로그램 150마이크로리터를 추가합니다. 플레이트를 실온에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후, 200마이크로리터의 PBS로 웰을 부드럽게 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 150마이크로리터의 PBS를 추가하고 488나노미터에서 형광을 기록합니다.