진균균사에서 박테리아를 형성하는 생물막을 시각화하기 위한 시료 전처리 방법

셀로판 결합 곰팡이 콜로니를 형광 표지 박테리아 현탁액에 도입합니다. 셀로판을 제거하고 배양합니다.

박테리아 세포는 표면 분자와 수용체를 통해 곰팡이 표면에 부착됩니다. 부착된 박테리아는 다당류, 단백질, DNA로 구성된 세포외 고분자 물질을 분비하여 박테리아 세포를 가두어 생물막의 구조적 기초를 형성합니다.

슨하게 결합된 박테리아를 제거하기 위해 강한 소금 용액으로 절편을 헹굽

인산염 완충액에서 콜로지의 일부를 자릅니다.

편을 밀 배아 응집소 또는 적색 형광 염료에 결합된 WGA를 함유한 멸균수로 옮깁니다.

식물성 단백질인 WGA는 N-아세틸글루코사민 및 시알산 잔기에 결합하여 부착된 염료가 진균 세포벽에 형광을 발하도록 합니다.

인산염 완충액으로 절편을 헹굽니다.

슬라이드를 버퍼에 부분적으로 담그십시오. 섹션을 그 위에 띄우십시오. 생물막 중단 없이 섹션이 가라앉도록 부드럽게 들어 올립니다.

장착 매체를 놓은 다음 현미경 분석을 위해 커버슬립을 놓습니다.

박테리아를 밤새 성장시킨 후, 배양액을 5,000배 g에서 3분 동안 원심분리한 다음 펠릿을 멸균 0.1몰 인산칼륨 완충액 25밀리리터에 현탁시킵니다. 원심분리를 반복한 후 동일한 완충액을 사용하여 최종 박테리아 농도를 밀리리터당 10에서 9번째 세포로 조정합니다.

6웰 마이크로플레이트에 5밀리리터의 박테리아 현탁액을 채웁니다. 멸균 면도날을 사용하여 곰팡이 배양물의 셀로판 막을 각 막에 단일 콜로니가 있는 정사각형으로 자릅니다. 그런 다음 집게를 사용하여 고체 배지에서 균사가 포함된 셀로판 사각형을 조심스럽게 제거하고 박테리아 현탁액의 개별 우물로 옮깁니다.

곰팡이 콜로니가 셀로판에서 분리될 때까지 마이크로플레이트를 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 접시에 곰팡이 콜로니를 남기고 셀로판 시트를 제거합니다. 마이크로플레이트를 섭씨 20도에서 부드럽게 교반하면서 사용된 균주와 분석할 단계에 따라 일정 시간 동안 배양합니다.

P. fluorescens BBc6/L. bicolor의 경우, 배양액을 30분 동안 배양하여 초기 단계의 생물막을 얻고, 성숙한 생물막을 얻으려면 최대 16시간 동안 배양합니다. 플랑크톤 박테리아와 균사에 정전기적으로 부착된 박테리아를 제거하려면 곰팡이를 강한 염 용액으로 채워진 새로운 6웰 마이크로플레이트로 옮겨 헹구십시오. 접시를 1분 동안 부드럽게 흔듭니다.

곰팡이를 멸균 0.1몰 인산칼륨 완충액 5밀리리터가 들어 있는 새로운 6웰 마이크로플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 2분 동안 부드럽게 흔든 다음 곰팡이를 신선한 완충액으로 옮깁니다.

곰팡이 군집을 완충 상태로 유지하면서 메스를 사용하여 군집을 약 반으로 자릅니다. 염색할 콜로니의 절반을 Alexa Fluor633에 접합된 밀 배아 응집소와 같은 진균 네트워크를 시각화하기 위해 적절한 형광 염료가 보충된 멸균수 1밀리리터가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다. 그런 다음 샘플을 어둠 속에서 배양합니다.

염색 후 샘플을 멸균 0.1몰 인산칼륨 완충액 10밀리리터가 들어 있는 페트리 접시 뚜껑에 옮겨 헹구고 1분 동안 부드럽게 흔듭니다. 페트리 접시 뚜껑에 슬라이드를 반쯤 담그고 절단된 부분을 슬라이드 위에 뜨도록 섬세하게 배치합니다. 그런 다음 완충 용액에서 측면을 천천히 들어 올려 샘플이 슬라이드에 부드럽게 가라앉도록 합니다.

가장 섬세한 측면은 슬라이드에서 샘플의 위치입니다. 생물막 파괴를 방지하려면 샘플을 배치하는 동안 샘플과 슬라이드를 담가야 하며 이미징 전에 샘플을 더 이상 이동해서는 안 됩니다.

마지막으로 10마이크로리터의 퇴색 방지 설치 매체를 샘플에 추가하고 유리 커버슬립으로 덮습니다.