컨포칼 현미경을 사용한 다양한 종양 영역에서의 상주 T 세포 이동에 대한 실시간 분석

상주 T 세포를 포함하는 폐 종양 절편으로 시작합니다.

T 세포는 종양 미세 환경을 통해 이동하고 종양 세포 및 간질 요소와 상호 작용하여 면역 기능을 수행합니다.

종양 미세 환경의 구성은 T 세포 변위와 속도에 큰 영향을 미칩니다.

미세 환경에서 T 세포, 종양 세포 및 간질 요소를 표지하기 위해 고유한 형광 결합 항체를 추가합니다.

손상된 원형질막으로 세포에 침투하여 핵을 염색하는 DAPI를 추가하여 종양 내 괴사 부위를 시각화할 수 있습니다.

공초점 현미경으로 염색된 샘플을 관찰합니다.

적절한 형광광을 사용하여 상주 T 세포를 포함하는 관심 종양 영역을 선택합니다. DAPI 양성 세포를 평가하여 세포 생존력을 평가합니다.

실시간 분석을 위해 시간 간격과 총 녹화 시간을 정의합니다.

z-스택 이미지를 캡처하려면 레이블이 지정된 T 세포 아래의 깊이에서 시작하여 다양한 시간 간격으로 이미지를 캡처합니다.

추적 소프트웨어를 활용하여 다양한 종양 영역에서 T 세포 변위 길이와 평균 속도를 비교합니다.

필요한 형광 표지 항체와 형광 핵 염료인 DAPI를 페놀 적색이 없는 RPMI 배지에서 필요한 최종 농도로 희석합니다. 그런 다음 인큐베이터에서 배양 플레이트를 제거하고 미세한 팁을 사용하여 스테인리스 스틸 와셔 내부의 액체를 흡인합니다.

이제 슬라이스를 건드리지 않고 희석된 항체 40마이크로리터를 각 종양 슬라이스에 추가합니다. 염색을 허용하려면 플레이트를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 염색 단계가 완료되면 미세한 집게를 사용하여 와셔를 제거합니다. 그런 다음 슬라이스를 부드럽게 꺼내 페놀 레드가 없는 RPMI1640 배지에 10초 동안 담그십시오. 슬라이스를 세포 배양 인서트에 다시 놓고 각 슬라이스 위에 페놀 레드가 없는 RPMI1640 배지 한 방울을 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 10분 동안 배양한 다음 이미징을 진행합니다.

이 실험을 시작하기 몇 시간 전에 현미경 가열 챔버의 온도를 섭씨 37도로 설정한 다음 산소화된 페놀 적색이 없는 RPMI 배지로 종양 절편을 지속적으로 관류하도록 설정된 현미경을 준비하고 연동 펌프를 사용하여 용액을 폐기물 수집 플라스크로 흡인합니다.

미세한 집게를 사용하여 염색된 슬라이스를 6웰 플레이트에서 들어 올려 페놀 레드가 없는 RPMI 배지로 채워진 35mm 플라스틱 접시에 옮긴 다음 슬라이스 위에 슬라이스 앵커를 놓아 지지합니다. 그런 다음 이 페트리 접시를 현미경의 이미징 스테이지에 놓습니다.

관류 시스템의 입구 및 출구 팁을 연결한 후 연동 펌프를 켜서 산소 매체가 관류관을 통과할 수 있도록 합니다. 침수 대물렌즈를 슬라이스로 낮추고 명시야광 또는 적절한 파장으로 슬라이스 상단에 초점을 맞춥니다.

그런 다음 적절한 필터를 사용하여 관심 있는 모든 형광 표지 세포, 즉 CD8 T 세포, 종양 섬 및 CD90 양성 간질 세포를 포함하는 관심 영역을 시각화하고 선택합니다. 관찰된 형광 신호의 밝기에 맞게 적절한 레이저 강도와 노출 시간을 사용하여 이미징 세션을 설정합니다. 그런 다음 종양 슬라이스 내에서 이미지를 찍을 Z-스택 두께를 설정합니다.

그런 다음 Z-스택 이미지 시간 간격과 총 녹화 시간을 선택하여 특정 시간 간격으로 이미지를 캡처합니다. 형광 이미지를 캡처하고 내보낸 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 CD8 T 세포 이동을 분석합니다.