Tau-Seed 유도 Reporter 단백질 응집을 검출하기 위한 FRET 유세포 분석 기법

미세소관 결합 단백질 타우의 반복 도메인을 발현하는 포유류 세포 배양을 취하십시오.

이러한 세포질 타우 리포터는 응집되기 쉬운 돌연변이를 가지고 있으며 단량체로 존재합니다.

리포터는 형광단 A 또는 B에 융합되며, 전자의 방출 스펙트럼은 후자의 흡수 스펙트럼과 겹칩니다.

타우 씨앗 또는 전장 타우의 섬유 응집체와 복합체화된 리포솜을 추가합니다.

세포에 들어가면 리포좀은 세포질의 씨앗을 방출합니다.

방출된 종자는 타우 리포터의 응집을 매개하여 형광단 A를 형광단 B 근처로 가져옵니다.

트립신을 첨가하여 세포를 분리한 다음 고정을 수행합니다.

유세포 분석기를 사용하여 세포를 분석합니다.

응집체 내의 근접성으로 인해 여기 시 쌍극자-쌍극자 상호 작용을 통한 형광단 A에서 B로의 에너지 전달을 형광 공명 에너지 전달 또는 FRET라고 합니다.

여기된 형광단 B는 FRET 신호를 방출하며, 이 신호의 존재는 단백질 응집을 나타냅니다.

멸균 조건에서 바이오센서 세포를 재도금하려면 각 세포주를 따뜻한 PBS로 헹구고 트립신-EDTA와 함께 3분 동안 배양합니다. 세포가 분리되면 따뜻한 배양 배지로 반응을 멈추고 즉시 세포를 원추형 튜브로 옮깁니다.

세포를 원심분리하고 펠릿을 신선한 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 세포의 수를 계산하고 배지 13밀리리터당 3,500,000개의 세포로 마스터믹스 세포를 희석합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 130마이크로리터의 세포를 평평한 바닥 조직 배양 처리 96웰 플레이트의 각 웰로 천천히 옮기고 피펫 팁을 플레이트 바닥에 닿지 않고 웰 중앙에 배치하도록 주의합니다.

세포가 도금되면 실온에서 10분 동안 방해받지 않고 침전시킨 다음 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 상대 습도 80% 이상에서 밤새 배양합니다. 다음날 바이오센서 세포가 60%에서 65% 합류하면 환원 혈청 배지, 리포솜 시약 및 생물학적 종자 공급원을 결합하여 형질도입 복합체를 만듭니다.

그런 다음 각 개별 바이오센서 웰의 측면에 20마이크로리터의 형질도입 복합체를 부드럽게 피펫팅하고 처리된 세포를 인큐베이터로 24-48시간 더 되돌립니다. 수확하기 전에 처리되지 않은 세포는 확산 형광만 나타냅니다. 그러나 타우 종자 물질로 처리된 세포는 1-2일 후에 밝은 응집체를 나타냅니다.

세포를 수확하려면 세포 배양 배지를 50마이크로리터의 트립신-EDTA로 교체하고 150마이크로리터의 냉각 배양 배지로 5분 후에 반응을