소형 흥분성 시냅스후 전류(mEPSC)에 대한 독소 노출의 억제 효과를 평가하는 기술

테스트 독소의 농도를 증가시키는 신경 배양을 치료합니다.

독소는 세포에 들어가 세포질로 방출됩니다.

잠재력에 따라 독소는 소포 융합을 방지하여 신경 전달 물질 방출을 억제할 수 있습니다.

배지를 특정 신경약리학적 화합물이 포함된 완충액으로 교체하여 신경 활동 전위를 차단합니다.

배양 접시를 전기생리학 단계에 놓습니다. 기록을 시작하려면 뉴런 체세포를 기록 전극이 포함된 피펫과 연결하십시오.

꾸준한 음압을 가하여 작은 멤브레인 부분을 흡인하여 녹음 중 간섭을 최소화하는 단단한 밀봉인 기가씰을 형성합니다.

신경 전류를 측정하기 위해 일정한 멤브레인 전압을 유지합니다.

음압 펄스를 가하여 멤브레인을 파열시켜 뉴런과 피펫 사이에 직접 접촉을 설정합니다.

mEPSC라고 하는 신경 전달 물질의 흡수로 인해 뉴런에서 생성된 전류를 기록합니다.

독소 노출 증가로 mEPSC 빈도가 감소하면 신경 전달 물질 방출이 억제되었음을 나타냅니다.

보툴리눔 신경독 혈청형 A를 ESN 배양 배지에서 원하는 최종 농도의 100배로 희석하고 섭씨 37도까지 따뜻하게 합니다. 그런 다음 DIV 21+ ESN 배양액에 적절한 양의 독소를 첨가합니다. 배양 접시를 소용돌이치고 인큐베이터로 돌아갑니다.

원하는 시점에서 ESN 배양 배지를 흡인하고 세포외 기록 완충액 또는 ERB로 두 번 세척합니다. 그런 다음 활동 전위를 차단하기 위해 5마이크로몰 테트로도톡신이 보충된 ERB 4밀리리터와 GABA_A 수용체 활성을 길항하기 위해 10마이크로몰 바이쿠쿨린을 추가합니다. 그런 다음 접시를 전기생리학 장비로 옮깁니다. 시냅스 전달 또는 MIST 분석의 측정된 억제를 위해 관류나 온도 제어가 필요하지 않습니다.

마이크로 피펫 풀러를 사용하여 5 내지 10 메가옴의 저항으로 붕규산 피펫을 당긴 후 세포 내 기록 완충액으로 피펫을 다시 채웁니다. 그런 다음 피펫을 실리콘화 시약에 부드럽게 담그십시오. 기록 피펫을 전극 홀더에 고정하고 전극 홀더에 포팅된 튜브에 공기가 채워진 주사기를 부착합니다. 기록 피펫을 ERB로 내리는 동안 주사기를 통해 일정한 양압을 제공합니다.

기록할 뉴런의 체세포에 기록 피펫을 부드럽게 착지한 후 주사기의 밀봉을 깨서 양압을 포착합니다. 주사기를 다시 연결하고 부드러운 흡기를 통해 지속적인 음압을 가하여 기가옴 밀봉을 형성합니다. 기가옴 씰이 형성되면 유지 전압을 영하 70밀리볼트로 줄인 다음 주사기를 사용하여 짧은 음압 펄스를 조심스럽게 적용하여 도매 구성으로 전환합니다.

30초 동안 정전 용량 스파이크를 모니터링하여 패치가 안정적인지 확인합니다. 해커 소프트웨어에서 정전 용량 스파이크를 취소하고 전류 클램프 모드로 전환하여 휴식 멤브레인 전위를 모니터링하고 기록합니다. 액체 접합 전위를 조정하지 않으면 휴식 막 전위는 마이너스 67에서 마이너스 82밀리볼트 사이여야 합니다.

게인을 피코암페어당 2밀리볼트로 조정합니다. 전압 클램프 모드로 전환하고 연속 마이너스 70밀리볼트를 수행하여 3-5분 동안 기록하여 소형 흥분성 시냅스 후 전류를 감지합니다.

미니 분석에서 AMPA 수용체 EPSC에 대한 기본 설정을 사용하여 3-5분의 기록된 데이터를 분석하여 MEPSC를 검출합니다. 감지된 이벤트에 대한 정보를 수집하고 저장합니다. 각 노출 조건에 대해 8-12개의 대조군과 8-12개의 보툴리눔 신경독 처리 샘플에 대한 mEPSC 빈도를 수집한 후, 연령 및 로트 일치 대조군에 대한 빈도를 분석합니다.