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면역학
0 조회수 • 3:22 분 • July 8th, 2025
중쇄 및 경쇄 항체 유전자에 대한 별도의 벡터가 들어 있는 튜브로 시작합니다.
형질감염 시약을 첨가하여 벡터와 복합체를 형성합니다.
이 혼합물을 포유류 숙주 세포로 옮기고 내재화를 위해 배양합니다.
응집 방지제를 첨가하여 형질감염된 세포의 균일한 분포를 촉진하여 세포 회복 및 성장을 개선합니다.
오염을 방지하기 위해 항균-항진균 용액을 첨가하십시오.
숙주 세포 내에서 벡터는 숙주 게놈에 통합됩니다.
유전자 전사 후 개별 mRNA는 핵을 빠져나와 번역을 거쳐 초기 항체 사슬을 형성합니다.
초기 사슬을 적절하게 접고 수정하면 무거운 사슬과 가벼운 사슬이 생성됩니다.
이 사슬은 결합하여 완전한 기능을 하는 항체를 형성한 다음 세포외 배지로 방출됩니다.
배지를 수확하고 원심분리합니다. 상청액을 여과합니다.
항체의 선택적 결합을 허용하는 정제 컬럼을 통해 여과액을 통과시킵니다.
용출 완충액을 사용하여 정제된 항체를 용리합니다.
200밀리리터의 배지에서 CHO 세포를 긴 삼각 배플 플라스크로 성장시킵니다. 5밀리리터의 CHO 프리스타일 배지와 50마이크로그램의 가변 중클론 DNA 및 75마이크로그램의 가변 라이트 클론 DNA를 15밀리리터 튜브에 결합합니다. 그런 다음 튜브를 소용돌이치십시오. 혼합물을 실온에서 5분 동안 그대로 두십시오. 750마이크로리터의 폴리에틸렌 아민 스톡 1밀리리터를 DNA 용액에 넣고 30초 동안 적극적으로 소용돌이
치게 합니다.혼합물을 실온에서 5분 더 둡니다. 플라스크를 수동으로 흔들면서 전체 혼합물을 CHO 셀에 추가합니다. 세포를 섭씨 37도에서 즉시 배양하면서 130RPM으로 흔듭니다.
다음날 100x 응집 방지제 2ml와 100x 항균 항진균제 용액 2ml를 세포에 첨가합니다. 플라스크를 섭씨 32도에서 34도에서 130RPM으로 흔들어 배양합니다. 10-11일 동안 세포를 계속 배양하고 5일마다 트립톤 N1 사료 10ml와 100x 글루타민 보충제 2ml를 추가합니다. 세포 생존율이 80% 이상으로 유지되도록 3일마다 세포 수를 계산합니다. 10일 또는 11일째에 배양액을 섭씨 3,000배 및 섭씨 4도에서 40 내지 60분 동안 원심분리하여 항체 정제를 위한 배지를 수확합니다. 그런 다음 0.22마이크로미터 병 필터로 투명 매체를 걸러냅니다.
항체를 정제하려면 단백질 A 컬럼을 2개의 컬럼 부피의 결합 완충액으로 평형을 유지합니다. 여과된 매체를 분당 1밀리리터의 유속으로 컬럼을 통과시킵니다. 그런 다음 두 컬럼 부피의 결합 완충액으로 컬럼을 세척합니다. 5밀리리터의 용출 완충액을 사용하여 항체를 500마이크로리터 분획으로 용리합니다.