메탈로펩티다아제에 대한 단클론 항체를 생산하기 위한 하이브리도마 기술

메탈로펩티다제로 면역된 마우스를 예로 들어 보겠습니다. 비장을 채취하여 세포 현탁액을 얻습니다.

메쉬와 원심분리기를 통해 현탁액을 여과하여 조직 파편을 제거합니다.

분리된 세포는 메탈로펩티다제 특이적 B 세포를 포함하며, 메탈로펩티다제 에피토프에 대한 항체를 산생한다.

HGPRT 효소가 결여된 불멸 골수종 세포를 추가하여 뉴클레오티드 합성을 위한 핵염기의 회수를 방지합니다. 그들은 새로운 뉴클레오티드 합성을 통해 생존합니다.

원심분리하여 펠릿을 얻고 상청액을 버립니다.

PEG를 첨가하고 배양하여 골수종-B 세포 융합을 유도하여 HGPRT 양성 불멸 하이브리도마를 형성합니다.

하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 HAT 배지를 첨가하십시오. 복막 대식세포 피더 층을 포함하는 웰로 옮겨 하이브리도마 성장을 촉진합니다.

아미노프테린은 새로운 뉴클레오티드 합성을 차단하여 융합되지 않은 골수종 세포를 죽게 합니다. 융합되지 않은 B 세포는 수명이 짧기 때문에 죽습니다.

HGPRT 양성 하이브리도마는 뉴클레오티드 전구체인 하이포잔틴과 티미딘을 구제하고 증식하며 메탈로펩티다제 특이적 단클론 항체를 분비합니다.

상청액을 수확하여 다운스트림 분석을 통해 항체 생산을 확인합니다.

시작하려면 최종 항원 부스트를 위해 선택된 성인 암컷 마우스에 100마이크로그램의 APM 단백질을 복강 주사합니다. 주사 3일 후 마우스의 비장을 채취한 후 DMEM으로 2회 세척하여 혈액과 지방 세포를 제거합니다.

200메쉬 구리 그리드를 사용하여 비장 세포 현탁액을 여과하여 조직 파편을 제거하고 원심분리를 사용하여 비장 세포를 수확하여 비장막을 제거합니다. 6% 소 태아 혈청이 보충된 DMEM 5밀리리터가 들어 있는 25제곱센티미터 플라스크에 마우스 SP2/0 골수종 세포를 시드하고 세포 생존력을 유지하기 위해 섭씨 37도 및 이산화탄소 6% 분위기에서 세포를 배양합니다.

배양 5-6일 후, 세포는 소생술 후 80% 내지 90% 합류에 도달해야 하며 현미경으로 둥글고 밝고 선명하게 나타납니다. 교배화 하루 전, 생쥐의 복강에서 대식세포를 수집합니다.

각각 100마이크로리터의 HAT 배지를 포함하는 96웰 플레이트에 밀리리터당 0.1 내지 0.2 배 10 내지 5분의 1의 밀도로 복막 대식세포를 시종하고 하룻밤 동안 배양합니다. 하이브리드화를 위해 피펫으로 SP2/0 세포를 8-10병으로 부드럽게 흡인하고 10밀리리터의 무혈청 DMEM 배지에