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면역학
0 조회수 • 3:38 분 • July 8th, 2025
양이온성 지질 기반 형질감염제가 들어 있는 튜브로 시작하여 재조합 발현 플라스미드를 추가합니다.
플라스미드는 하나의 프로모터 아래에 메탈로펩티다제 표적 재조합 항체와 녹색 형광 단백질 또는 GFP를 암호화하는 유전자를 운반하는 반면, 항생제 내성 유전자는 다른 프로모터 아래에 있습니다.
양전하를 띤 지질은 음전하를 띤 플라스미드와 상호 작용하여 복합체를 형성합니다.
복합체를 포유류 세포가 포함된 멀티웰 플레이트로 옮겨 플라스미드가 세포질에 들어갈 수 있도록 합니다.
플라스미드는 핵에 도달하여 항생제 내성 단백질에 대한 mRNA와 재조합 항체 및 GFP를 암호화하는 바이시스트로닉 mRNA로 전사됩니다.
이러한 mRNA는 재조합 항체, GFP 및 항생제 내성 단백질의 생산으로 이어집니다.
형질감염 후 배지를 혈청이 풍부한 배지로 교체하십시오.
항생제를 도입하여 형질감염되지 않은 세포를 선택적으로 제거하고 항생제 내성 형질감염된 세포가 생존합니다.
형광 활성화 세포 분류 기술을 사용하여 재조합 항체를 발현하는 녹색 형광 세포를 수집합니다.
희석된 형질감염된 세포를 무혈청 배지에 시드하고 배양하여 메탈로펩티다제에 대한 재조합 항체를 생성합니다.
섭씨 37도의 궤도 셰이커에서 0.4밀리몰 베타-D-1-티오갈락토피라노사이드의 존재 하에서 BL21 형질전환 박테리아에서 pET-28a(+) 재조합 항체 아미노펩티다제를 10시간 동안 성장시킵니다. 웰당 100마이크로리터 0.5 x 105개의 차이니즈 햄스터 난소 세포를 96웰 플레이트에 시드하여 6% 이산화탄소 분위기에서 섭씨 37도에서 18 내지 24시간 동안 배양합니다.
세포가 80% 내지 90% 합류에 도달하면 플라스미드에서 pIRES2-ZsGreen1 재조합 항체 아미노펩티다아제를 Opti-MEM으로 마이크로리터당 0.1마이크로그램의 최종 농도로 희석합니다. 5분 후, 플라스미드에 희석된 pIRES2-ZsGreen1 재조합 항체 아미노펩티다제 50마이크로리터를 1마이크로리터의 Lipofectamine 2000 및 49마이크로리터의 Opti-MEM과 혼합합니다.
배양 20분 후, CHO 세포가 포함된 96웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 혼합물을 첨가합니다. 형질감염 후 4-6시간 후에 배지를 10% FBS가 보충된 DMEM/F12로 교체합니다.
배양 48시간 후, 각 웰에 마이크로리터 G418당 400마이크로그램을 첨가하여 안정적으로 형질감염된 세포를 선택합니
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