0 조회수 • 3:52 분 • July 8th, 2025
쥐 배아 해마를 예로 들어 보겠습니다.
트립신을 첨가합니다. 배양하여 조직 기질 분해를 매개하여 해마 세포를 풀어줍니다.
완충액으로 희석하십시오. 트립신과 함께 지속적인 효소 소화를 위해 배양합니다.
다음으로, 조직 덩어리를 배지 함유 튜브로 옮깁니다. 단일 세포로의 기계적 해리를 위해 반복적으로 피펫팅합니다.
배양 플레이트 내의 폴리-L-라이신 코팅 커버슬립에 종자 세포.
인큐베이트. 해마 세포는 코팅된 표면에 부착됩니다. 뉴런은 라멜라를 발달시키고 소신경돌기를 확장합니다.
또한, 신경돌기는 축삭 및 수지상 과정과 함께 성장하여 신경 네트워크를 형성합니다.
성숙한 뉴런은 시냅스 흥분 수용체, N-메틸-D-아스파르테이트 수용체 또는 NMDAR를 발현합니다.
배양 후 커버슬립을 매체로 세척하십시오.
희석된 자가면역 뇌염 환자 혈청을 추가합니다. 자가항체는 뉴런 NMDAR에 결합합니다.
완충액으로 세척한 다음 세포를 고정합니다.
NMDAR 결합 자가항체에 결합하는 형광단 표지 2차 항체를 추가합니다.
완충액으로 씻으십시오. DAPI가 포함된 마운팅 매체 위에 커버슬립을 놓아 핵을 염색합니다.
뉴런의 형광 신호를 현미경으로 관찰하여 혈청에 자가항체가 존재함을 나타냅니다.
해마가 들어 있는 50밀리리터 튜브에서 2.5% 트립신 1밀리리터에서 해마의 효소 해리를 위해 HBSS로 튜브의 부피를 5밀리리터로 만든 후 섭씨 37도의 수조에서 튜브를 15분 동안 배양합니다. 트립신을 더 희석하려면 예열된 HBSS 10밀리리터를 넣고 튜브를 섭씨 37도로 설정된 수조에 5분 동안 다시 넣습니다.
다음으로, 1,000마이크로리터 마이크로피펫을 사용하여 점액 덩어리로 나타나는 해마를 50밀리리터 튜브로 옮기고, 시연된 대로 예열된 HBSS 6밀리리터와 함께 조직을 5분 동안 배양합니다. 조직을 기계적으로 해리시키려면 해마 덩어리를 바닥이 원추형인 2밀리리터 튜브로 옮깁니다. 예열된 DMEM 배지 1밀리리터를 첨가한 후, 1,000마이크로리터 마이크로피펫으로 상하로 부드럽게 흡인하여 펠릿을 균질화합니다.
기포가 생기지 않도록 혼합물이 반투명해질 때까지 팁이 튜브의 원추형 바닥에 닿도록 미리 당긴 유리 피펫을 사용하여 상하 흡인을 10-20회 반복합니다. 교차 흔들리는 움직임으로 3.5cm 접시에 고르게 분배하기 전에 세포를 세십시오. 완료되면 접시를 5% 이산화탄소가 담긴 인큐베이터에 넣습니다.
14일 체외 세포의 형광 면역염색을 위해 항-NMDAR 항체를 함유한 샘플을 커버슬립에 첨가하고 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 배양합니다. 1시간 후, 샘플을 고정 용액으로 PBS의 4% 포름알데히드로 실온에서 5분 동안 처리합니다. 그런 다음 샘플을 PBS로 각각 5분 동안 세 번 세척한 후 2차 항체 염소 항인간 Alexa Fluor 488을 실온에서 1시간 동안 1 내지 1,000 희석으로 첨가합니다. 다음으로, 샘플이 들어 있는 커버슬립을 액체 장착 매체로 장착하고 남아 있는 액체를 흡인합니다.