전기화학발광 분석을 사용한 human islet 자가항체 검출

제1형 당뇨병의 바이오마커인 섬 자가항체를 검출하려면 인간 혈청 샘플을 채취하고 아세트산을 첨가하여 간섭 성분을 억제합니다.

배양한 다음 알칼리성 완충액을 첨가하여 산을 중화시킵니다.

처리된 혈청을 비오티닐화 포획 및 루테늄 접합 항원을 포함한 인간 섬 자가항원의 혼합물을 포함하는 멀티웰 플레이트로 옮깁니다.

양성 샘플의 섬 자가항체는 루테늄-접합 항원을 비오티닐화된 포획 항원에 연결하여 항원-항체 복합체를 형성합니다.

혼합물을 차단제로 전처리되고 작동 및 대전극이 장착된 스트렙타비딘 코팅 전기화학발광판으로 옮깁니다.

결합된 스트렙타비딘과 비오티닐화된 복합체 상호작용을 허용하도록 배양한 다음 세척합니다.

트리프로필아민 또는 TPA를 포함하는 완충액을 추가합니다.

전기화학발광 기기에서 전극 사이에 전압을 인가하면 루테늄과 TPA의 산화가 시작되어 TPA 라디칼이 생성됩니다.

TPA 라디칼은 루테늄 복합체를 여기시켜 바닥 상태로 돌아가는 동안 광자를 방출합니다.

양성 샘플의 높은 화학발광은 섬 자가항체의 존재를 나타냅니다.

인간 섬 자가항원을 비오틴 또는 설포 태그와 튜브에 1:5 몰 비율로 혼합하고 두 태그 모두 빛에 민감하므로 튜브를 알루미늄 호일로 덮습니다. 그런 다음 튜브를 실온에서 한 시간 동안 배양합니다. 한편, 배양이 진행될 때 스핀 컬럼을 2중 인산염 완충 식염수로 프라이밍합니다.

그런 다음 컬럼을 1,000배 g으로 매번 2분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 스핀 컬럼에서 자가항원 태그 혼합물을 1,000배 g으로 2분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 표지된 항원을 분취하여 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

다음으로, 항원 완충액에 대한 바둑판 분석을 기반으로 한 비오틴 설포 태그 표지 항원의 합리적인 농도를 사용하여 96웰 플레이트당 3밀리리터의 항원 용액을 준비합니다.

그런 다음 각 웰에 4마이크로리터의 혈청을 추가하고 1배 인산염 완충 식염수로 최종 부피를 20마이크로리터로 조정합니다. 그런 다음 각 웰에 20마이크로리터의 표지된 항원 용액을 추가하고 빛을 방지하기 위해 밀봉 호일로 플레이트를 덮습니다. 그런 다음 접시를 실온의 셰이커에 2시간 동안 옮깁니다.

셰이커가 멈추면 접시를 섭씨 4도에서 냉장고에 18-24시간 동안 두십시오. 이제 각 샘플에 대해 15마이크로리터의 혈청과 18마이크로리터의 0.5몰 아세트산을 혼합하고 실온에서 45분 동안 배양합니다.

바둑판 분석을 기반으로 비오틴 설