계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 Biophysical Assays : 기판 스트레인 신청 및 Microneedle 조작

다음 실험들의 전반적인 목표는 세포핵 인터페이스의 기계적 특성과 주변 세포골격과의 물리적 연결 상태를 측정하는 것입니다. 이는 투명 실리콘 막 위에 배양된 세포에 기계적 변형(mechanical strain)을 가하고, 이로 인해 유도된 핵 변형을 이미징함으로써 수행됩니다. 핵 변형의 증가는 핵 강성의 감소에 해당하며, 핵과 세포골격 간 결합의 변화 또한 유도된 핵 변형에 영향을 줄 수 있습니다.

세포골격에 국소적인 변형(strain)을 가함으로써 세포골격과 핵 사이의 세포 내 힘 전달을 직접적으로 측정합니다. 이후 형광 표지된 NU 핵 및 세포골격 구조의 변위를 이미징합니다. 이를 통해 주변 세포골격 대비 세포핵의 강성(stiffness)을 나타내는 결과를 얻습니다.

기질 변형 실험을 바탕으로 한 마이크로니들 조작 분석 결과, 핵-세포골격 결합의 붕괴가 세포 내 힘 전달의 결함으로 이어진다는 것이 밝혀졌습니다. 분리된 핵의 마이크로피펫 흡인과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 정상적인 세포 구조를 방해하지 않고 살아있는 온전한 세포의 핵 역학을 측정할 수 있다는 점입니다. 이러한 방법들은 핵막 구성의 변화가 핵의 기계적 특성에 어떠한 영향을 미칠 수 있는지에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

이 방법들은 또한 LA 신경병증이나 암과 같은 질환의 맥락에서 핵 역학의 역할을 연구하는 데 적용될 수 있습니다. 각 신장 디쉬(strain dish)는 직경 3인치의 맞춤 제작된 바닥 없는 플라스틱 디쉬와 세포 배양 기질 역할을 하는 실리콘 막을 고정하기 위한 플라스틱 O-링으로 구성됩니다. 신장 디쉬를 준비하려면 4인치 x 4인치 크기의 실리콘 막 조각을 O-링과 디쉬 사이에 고정시킨 뒤, 남은 막 부분을 조심스럽게 잘라내고, 신장 디쉬를 탈이온수로 헹구고, 세포외 기질 분자로 실리콘 막을 코팅하기 전에 디쉬를 오토클레이브(autoclave) 처리하며, 막의 바닥 중앙 외부 쪽에 기준점을 표시합니다.

이 랜드마크는 단축 변형 적용을 위한 변형 실험 동안 동일한 세포를 식별하는 데 도움이 됩니다. 기준점 주변에 스카치테이프를 두 개의 평행한 스트라이프로 부착하여 한 차원에서의 막 형성을 제한합니다. 최적의 세포 부착을 위해, 실리콘 막을 3 µg/mL의 fibronectin 또는 적절한 세포외 기질 단백질로 코팅하십시오.

스트레인 디쉬를 뒤집은 10 centimeter 폴리스티렌 디쉬로 덮고, 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 과량의 단백질을 제거하기 위해 멤브레인을 PBS로 한 번 헹굽니다. 디쉬에 10 milliliters의 성장 배지를 채우고 그대로 둡니다.

코팅된 실리콘 막 디쉬가 준비되면, 0.05% trypsin으로 세포를 처리한 후 부착성 세포를 성장 배지가 담긴 디쉬에 분주합니다. 이 과정은 마우스 배아 세포를 사용하여 시연되었습니다.

섬유아세포 또는 중간엽 세포를 일반 배양 조건에서 24~48시간 동안 배양합니다. 기질 변형 실험용 도구가 장착된 도립 현미경에는 현미경 스테이지에 고정되는 베이스 플레이트로 구성된 변형 장치가 포함되어 있습니다. 이 플레이트는 중앙의 원통형 플래틴을 고정하며, 이는 실리콘 막의 중앙 섹션에 변형을 가하는 역할을 합니다.

이 장치에는 strain dish를 고정하며 4개의 가이드 핀을 따라 상하로 슬라이딩할 수 있는 이동식 플레이트와, 하중을 가하기 위한 5 pound 무게추가 포함되어 있습니다. 핵을 시각화하려면, strain dish 내의 세포를 1 µg/mL의 hooked stain과 함께 37 °C에서 15분 동안 배양하십시오. 배양 후, 배지를 흡입하여 제거하고 25 mM heis가 포함된 phenol red free 성장 배지 15 mL로 교체하십시오.

그런 다음 디쉬를 디쉬 홀더에 나사로 고정한 후, 실리콘 멤브레인이 중앙 플라틴(Platin)을 따라 원활하게 미끄러질 수 있도록 멤브레인 바닥의 가장자리에 그리스를 조심스럽게 바릅니다. 이때 멤브레인의 중앙 부분에는 그리스가 묻지 않도록 주의하십시오. 베이스 플레이트를 현미경 스테이지 플레이트 위에 놓고, 베이스 플레이트에 디쉬 홀더를 조심스럽게 장착합니다.

초기 휴지 상태에서 스트레인 디쉬의 실리콘 막이 중앙 플래틴 위에 느슨하게 놓여 있는지 확인하십시오. 다음으로, 실리콘 막의 바닥면에 초점을 맞추고 중앙의 검은색 참조 점을 찾으십시오. 이 점은 모든 이미지 획득의 시작점 역할을 하며, 신장 중 및 신장 후 동일한 세포를 찾는 데 도움을 줍니다.

이 이미지에서 중앙의 점이 시야 전체를 채우고 있습니다. 점의 경계 부분부터 시작하여 초점을 조절해 세포와 실리콘 멤브레인의 상단을 시각화하십시오. 핵이 중앙에 위치하고 잘 퍼져 있는 세포를 찾으십시오.

세포 윤곽과 실리콘 막에 초점을 맞춘 위상차 이미지를 획득합니다. 그런 다음 핵의 중앙 평면에 초점을 맞춘 nuclear hook 염색 형광 이미지를 획득합니다. 5~15개의 세포 이미지를 모두 획득한 후, 다시 중앙 점으로 이동합니다.

균일한 변형이 가해지도록 스트레인 디쉬에 무게추를 천천히 가합니다. 디쉬의 중앙 부분에서, 기판에 가해지는 최대 변형량은 수직 정렬 핀에 배치된 나일론 스페이서에 의해 제한됩니다. 변형을 가한 후, 실리콘 막의 바닥면에 초점을 맞추고 기준점을 다시 찾아 해당 점부터 시작합니다.

동일한 세포들을 다시 찾아가서, 초기 이미지의 초점 평면과 최대한 일치하도록 노력하며 완전한 변형 상태에 있는 각 세포 핵의 위상차 이미지와 형광 이미지를 다시 획득합니다. 세포가 낯선 기질에 대해 활발하게 리모델링하고 적응하는 것을 방지하기 위해 이 과정은 10분을 초과해서는 안 됩니다. 모든 해당 이미지를 획득한 후, 현미경 스테이지를 시작 지점으로 되돌립니다.

디쉬 홀더 플레이트에서 무게추를 조심스럽게 제거하고, 필요한 경우 실리콘 멤브레인이 이완되도록 둡니다. 스트레인 디쉬를 초기 위치에 올 때까지 부드럽게 밀어 올립니다. 그런 다음 위상차 및 형광 영상을 획득합니다.

변형 전 이미지에 대해 설명한 것과 동일하게 변형 후 세포 이미지를 촬영하며, 변형 적용 전, 적용 중 및 적용 후의 세포와 형광 표지된 핵 이미지를 분석하여 정규화된 핵 변형(normalized nuclear strain)을 계산합니다. 본 시연에서는 분석을 위해 맞춤 제작된 MATLAB 스크립트를 사용하지만, 수동으로 기판 변형을 계산하기 위한 여러 대안적인 방법도 가능합니다. 대응하는 변형 전 및 변형 후 이미지 사이의 막에 위치한 3~6개의 제어점 위치를 일치시킵니다. 그 후 MATLAB 프로그램이 변형 전 이미지와 완전 변형 이미지 사이의 일치하는 제어점 위치를 비교하여 적용된 막 변형을 계산합니다.

또한 사전 변형 이미지와 사후 변형 이미지 사이의 잔류 변형률에 대해 위치를 비교합니다. 제어점은 이미지 쌍을 등록하는 데 동시에 사용되며, 이는 손상되거나 분리되는 세포를 검출하는 데 도움이 됩니다. 다음으로, 개별 핵의 핵 변형률을 계산하는 별도의 MATLAB 프로그램을 사용하여 핵을 수동으로 선택합니다.

이는 전체 변형 전후의 대응하는 형광 이미지 간의 핵 크기를 맞추거나, 서로 다른 실험 간에 가해진 막 변형의 미세한 차이를 보정하기 위해 핵 내 마커를 맞춤으로써 달성됩니다. 결과는 정규화된 핵 변형으로 표시됩니다. 이는 각 핵에 대해 계산된 가해진 막 변형에 대한 유도된 핵 변형의 비율로 정의됩니다.

MATLAB 스크립트는 요청 시 lambing 연구실에서 제공받을 수 있습니다. 마지막 단계로, 각 핵을 검증하며 변형 적용 중에 분리되거나 손상된 세포의 측정값은 제외합니다. 실리콘 막의 서로 다른 두 영역에 퍼진 MEF를 20% UNI 축 방향 변형 적용 전, 중, 후에 위상차 및 형광 현미경으로 촬영하였으며, 여기에는 손상이나 분리 없이 변형 적용에서 살아남은 세포의 유효한 핵이 포함된 성공적인 실험 사례가 제시되어 있습니다.

반면, 여기 표시된 세포들은 변형(strain) 인가 중에 수축하거나 부분적으로 박리되어 분석에서 제외되었습니다. 왼쪽의 세포는 세포골격 손상과 핵 붕괴의 징후를 보이며, 오른쪽의 세포는 변형 인가 중에 부분적으로 박리되고 수축합니다. 이는 과도한 변형이 가해졌음을 나타내는 지표가 될 수 있습니다.

여기에서 Lamin A/C 결핍 마우스의 다양한 meth 세포주 패널에서 정규화된 핵 변형(normalized nuclear strain)을 분석한 결과가 제시되어 있습니다. 이 세포들은 대조군인 야생형 리터메이트(litter mates)의 meth 세포와 비교하여 공벡터(empty vector) 또는 야생형 lamin A를 이소성으로 발현합니다. 핵막 단백질인 Lamin A/C의 발현 소실은 정규화된 핵 변형의 증가를 초래합니다. 이는 핵 강성(nuclear stiffness)의 감소를 나타내며, 야생형 Lamin A를 재도입함으로써 부분적으로 또는 완전히 회복될 수 있습니다. 마이크로니들 조작 실험을 준비하기 위해, 35 mm 유리 바닥 세포 배양 접시를 저농도의 fibronectin으로 37 °C에서 2시간 동안 배양하십시오. 배양 후, 접시를 HBSS로 두 번 세척하고 2 mL의 성장 배지를 접시에 추가하십시오.

그 후 생쥐 배아 섬유아세포를 0.05% trypsin으로 처리한 다음, 2 mL의 성장 배지가 담긴 피브로넥틴 코팅 유리 바닥 디쉬에 분주합니다. 단일 부착성 비합류 세포를 얻기 위해 세포를 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양하며, 세포 염색을 위해 성장 배지에 MitoTracker 미토콘드리아 염색약과 Hoechst 핵 염색약을 첨가합니다. 이 성장 배지를 세포에 가한 후 인큐베이션을 수행합니다.

다음으로, 상온에서 5분 동안 Hank's buffered salt saline에 배양하여 세포를 세척합니다. 그 후, 이미징을 위해 25 millimolar HEPES가 포함된 phenol red free 성장 배지를 세포에 첨가합니다.

마이크로니들 실험을 위해, 미리 제작된 마이크로니들을 디지털 전하결합소자(charge coupled device) 카메라가 장착된 도립 현미경과 연결된 마이크로 매니퓰레이터에 삽입하십시오. 마이크로니들의 초점을 단일 세포 근처에 맞추십시오. 마이크로니들을 세포골격에 삽입하지 않은 상태에서 단일 세포의 이미지를 하나 획득하십시오.

위상차 이미지, hooks 3 3, 3 4 2 염색의 형광 이미지 1장, 그리고 미토콘드리아 염색의 형광 이미지 1장을 도립 현미경의 60 x 대물렌즈와 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 촬영합니다. 마이크로 니들을 핵 주변부로부터 일정 거리 떨어진 세포질 내로 조심스럽게 삽입한 후, 위상차 이미지 1장, hooks 3 3, 3 4, 2 염색의 형광 이미지 1장, 그리고 미토콘드리아 염색의 형광 이미지 1장을 촬영합니다. 컴퓨터 제어 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 마이크로 니들을 초당 1 µm의 속도로 세포 주변부를 향해 특정 거리만큼 이동시키며, 10초마다 자동으로 이미지를 획득합니다.

마이크로니들이 세포 주변부의 특정 거리로 이동함에 따라, 일관된 미세 조작을 달성하기 위해 마이크로 매니퓰레이터를 컴퓨터로 제어해야 합니다. 절차의 마지막 단계에서는 마이크로니들을 제거한 후 이미지를 획득하며, 마이크로니들 조작 전, 중, 후에 획득한 핵과 세포골격의 형광 표지 특성 이미지들을 분석하여 작은 세포 내 영역의 변위를 계산합니다. 본 시연에서는 분석을 위해 맞춤 제작된 MATLAB 스크립트를 사용하지만, 이 외에도 여러 다른 옵션들을 사용할 수 있습니다.

마이크로니들에 의해 생성된 변위를 측정하기 위한 MATLAB 스크립트는 Lambing 연구실에 요청하여 제공받을 수 있습니다. 이 MATLAB 프로그램은 정규화된 상호 상관 알고리즘(normalized cross correlation algorithm)을 사용하여 형광 표지된 특징점의 원래 위치와 새로 식별된 위치 사이의 이동량을 계산합니다. 이후 변위는 벡터 맵으로 표시되며 수치 값으로 저장됩니다.

다음 단계는 결과로 얻은 변위 벡터 맵을 사용하여 matlab으로 세포골격 또는 핵 내의 평균 변위를 결정하는 것입니다. 먼저, 변형 적용 부위의 세포골격 내에서 3개 이상의 지점을 선택합니다. 변위 벡터 맵에서 평균 수치를 취하여 마이크로니들 적용 중에 발생한 적용 부위 근처의 세포골격 변형량을 결정합니다.

다음으로, 변형 적용 부위 근처의 핵 내에서 3개 이상의 지점을 선택하여 평균값을 구합니다. 이 값은 마이크로니들 적용 부위 근처의 핵 변형량을 나타냅니다. 동일한 방법으로, 각각의 해당 영역에서 선택한 지점들을 통해 변형 적용 부위에서 떨어진 핵 및 세포골격의 변형량을 측정합니다.

세포 내 힘 전달을 측정하기 위해 마이크로니들 조작 분석을 수행하였습니다. 여기에는 청색 핵 염색약과 MIT tracker green 미토콘드리아 염색약으로 표지된 섬유아세포의 위상차 이미지와 형광 이미지가 나타나 있습니다. 마이크로니들을 핵으로부터 정해진 거리의 세포골격에 삽입한 후, 세포 주변부 방향으로 이동시켰습니다.

세포골격 변형 전, 중, 후에 미토콘드리아의 변위(displacement)를 추적하고, 해당 변위를 벡터로 도식화하였습니다. 각 벡터는 원래 위치와 새롭게 식별된 위치 사이의 이동 거리로 계산된 변위를 나타냅니다. 이미지 강도가 낮거나 텍스처가 불충분한 영역은 분석에서 제외되었습니다.

그 후 대조군 섬유아세포와 섬유아세포 모두에서 변형 적용 지점으로부터 거리가 멀어짐에 따라 선택된 영역의 세포골격 및 핵 변위를 정량화하였습니다. 핵-세포골격 결합이 온전한 세포에서는 힘이 세포 전체로 전달되어, 변형 적용 지점에서 멀어질수록 서서히 소멸하는 유도된 핵 및 세포골격 변형이 나타납니다. 이와 대조적으로, 핵-세포골격 결합이 손상된 세포는 적용 지점 근처에서 국소적인 변위를 보이며, 그 너머에서는 유도된 변형이 거의 나타나지 않습니다.

대조군 섬유아세포와 핵-세포골격 결합이 파괴된 섬유아세포 모두에서 마이크로니들 삽입 부위의 세포골격 변형 적용 정도는 유사하게 관찰되었습니다. 하지만 다른 영역에서 유도된 핵 및 세포골격 변위는 핵-세포골격 결합이 파괴된 섬유아세포에서 대조군 세포보다 유의하게 더 작았습니다. 따라서 변형 적용 부위에서 떨어진 곳의 세포골격 및 핵 변위 감소는 세포골격과 핵 사이의 강제 전달이 방해되었음을 나타냅니다.

이 영상을 시청하신 후에는 핵 역학 및 핵과 세포 골격 사이의 세포 내 힘 전달을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 이러한 기술을 사용하여 핵막 단백질의 돌연변이 효과나, 발생 과정 또는 암 발생 중에 나타나는 핵막 구성의 변화를 연구할 수 있습니다.