Name: 계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 Biophysical Assays : 기판 스트레인 신청 및 Microneedle 조작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 27 s
Description: 배우세요 기판 스트레인 및 마이크로니들 조작을 활용한 계면 세포 핵의 기계적 성질 측정 방법을 통해 세포 핵 경도와 세포골격 간 힘 전달 메커니즘을 분석하는 생물물리학 기법을 익히세요.

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이 작품은 건강 (R01 HL082792 및 R01 NS059348) 및 Brigham 및 여자의 병원 순환기 리더십 그룹 수상의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+mechanics+during+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear mechanics during cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).</li>
<li>Mejat, A., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">LINC complexes in health and disease.</a> Nucleus. 1, 40-52 (2010).</li>
<li>Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminopathies+and+the+long+strange+trip+from+basic+cell+biology+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy.</a> J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).</li>
<li>Caille, N., Tardy, Y., Meister, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+strain+field+in+endothelial+cells+subjected+to+uniaxial+deformation+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Assessment of strain field in endothelial cells subjected to uniaxial deformation of their substrate.</a> Ann Biomed Eng. 26, 409-416 (1998).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> J Biol Chem. 281, 25768-25780 (2006).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+nuclear+shape+and+impaired+mechanotransduction+in+emerin-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Abnormal nuclear shape and impaired mechanotransduction in emerin-deficient cells.</a> J Cell Biol. 170, 781-791 (2005).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).</li>
<li>Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mechanosensitivity+and+nuclear+stiffness+in+Hutchinson-Gilford+progeria+cells%3A+effects+of+farnesyltransferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors.</a> Aging Cell. 7, 383-393 (2008).</li>
<li>Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+to+muscle+fibres+after+single+stretches+of+passive+and+maximally+stimulated+muscles+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice.</a> J Physiol. 488, 459-469 (1995).</li>
<li>Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+mechanical+connections+between+integrins%2C+cytoskeletal+filaments%2C+and+nucleoplasm+that+stabilize+nuclear+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure.</a> Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

기판의 변형 분석 스트레인 응용 프로그램이 성공적으로 기계적 스트레스를 받게 세포에서 유도된 핵 deformations을 공부하고 핵 강성 특정 핵 봉투 단백질의 기여를 조사하기 위해 우리와 다른 그룹에 의해 사용되고 있습니다. 4-8이 기법의 장점은 뭔가가 프로브 기계적 특성을 자신의 정상 세포와 cytoskeletal 환경에서 그 핵 생활 기판 변형 응용 프로그램과 같은 계약 근육이나 혈관 벽 많은 조직에서 발견 생리로드 응용 프로그램과 유사합니다. 9 또한, 그것은 숫자를 증가, 병렬로 많은 세포 변형 응용 프로그램을 수 한 실험에 분석할 수있는 세포. 기판 변형 분석 중 하나는 한계는 핵 강성의 직접 측정을 허용하지 않는다는 것입니다. 대신,이 방법은 주변 cytoskeleton에 비해 핵의 상대 강성을 결정합니다. 야생 형 세포에서 cytoskeletal 변형율이 적용 기판 변형에 비해입니다 uniaxial 기판 변형 표시 대상이 세...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> Millipore </td><td> FC010 </td></tr><tr><td> MitoTracker 레드 FM 그린 FM </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 및 M - 7514 </td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td></tr><tr><td> 행크의 버퍼 소금 염분 </td><td> Invitrogen </td><td> 14,185 </td></tr><tr><td> 페놀 무료, DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 21,063 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Aleken 체액 </td><td> FBSS500 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> 시그마 </td><td> P0781 - 100ML </td></tr><tr><td> 필라멘트와 Borosilicate 유리 </td><td> 셔터 악기 </td><td> BF100 - 78-10 </td></tr><tr><td> &quot;/ 광택 이외의 철근 실리콘 판금, 0.005를 광택 </td><td> 전문 제조 주식 회사 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 인산은 염분 버퍼 </td><td> Invitrogen </td><td> 14,200 </td></tr><tr><td> 35mm 유리 바닥 문화 요리 (FluoroDish) </td><td> 세계 정밀 계측기, INC </td><td> FD35 - 100 </td></tr><tr><td> Braycote 804 진공 그리스 </td><td> SPI 공급 </td><td> 05133A - AB </td></tr></tbody></table>

계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 biophysical assays : 기판 스트레인 신청 및 microneedle 조작

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

대부분의 진핵 세포에서 핵이 가장 큰 organelle이며, 일반적으로 주변 cytoskeleton보다 2-10 배 stiffer이며 따라서 핵의 물리적 특성은 생리와 병리 학적 조건에서 세포의 전반적인 biomechanical 행동에 크게 기여하고 있습니다. 예를 들어, neutrophils를 마이 그 레이션 및 암 세포를 침해에 핵 강성이 조직 내의 좁은 공간을 통해 넘쳐 흐름 또는 통과하는 동안 중요한 장애물을 일으킬 수 있습니다. 1 한편, 같은 근육과 같은 기계적으로 적극적인 조직에있는 세포의 핵은 충분한 구조적 지원을 필요로 반복적인 기계적 스트레스를 견딜 수. 중요한 것은, 핵은 단단히 휴대폰 아키텍처에 통합되어, 그것은 육체적으로 양극 세포, 신경근육학 분기점에서 시냅스 핵의 예를 들어 세포 운동과 핵의 위치를​​위한 중요한 요구 사항,있는 주변 cytoskeleton에 연결하거나, 마이 그 레이션 세포 2. 아니 놀랍게도, 그러한 핵 강성 및 nucleo - cytoskeletal 커플링을 결정하는 중요한 역할을 lamins 및 nesprins 같은 핵 봉투 단백질에 돌연변이가,를 포함하여 인간의 질병의 여러 결과에 최근 게재되었습니다 에머리 - Dreifuss 근육 영양 장애, 사지 - 거들 근육 영양 장애, 그리고 확장성 심근증 3. 다양한 핵 봉투 단백질과 특정 돌연변이의 효과의 biophysical 기능을 조사하기 위해, 우리는 하나의 살아있는 세포에있는 핵의 물리적 특성을 연구하는 실험 방법을 개발 글로벌 또는 지역화된 기계 섭동를 받게. 정확하게 적용 기판 변형 응용 프로그램에 대한 응답으로 유도 핵 deformations를 측정하면 핵의 deformability에 대한 중요한 정보를 산출하고 다른 돌연변이 또는 특정 핵 봉투 단백질에 대한 결함 세포 라인 사이의 양적 비교를하실 수 있습니다. microneedle로 현지화된 cytoskeletal 변형 응용 프로그램이 분석을 보완하는 데 사용되고 핵과 cytoskeleton 세포 사이의 강제 전송에 대한 추가 정보를 얻을 수 있습니다. 그대로 살아있는 세포의 핵 역학을 공부하는 것은 정상적인 세포 구조를 유지하고 고립 핵 작업시 발생할 수있는 잠재적인 유물을 방지합니다. 또한, 기판의 변형 응용 프로그램은 근육이나 다른 조직의 세포 (예를 들어, 혈관 평활근 세포는 혈관 변형에 노출)에 의해 경험 생리적 스트레스에 대한 좋은 모델을 제공합니다. 이러한 도구는 핵 역학 연구를 주로 개발되었습니다 동안 마지막으로, 그들은 또한 cytoskeletal 단백질과 mechanotransduction 신호의 기능을 조사하기 위해 적용할 수 있습니다.

우리는 글로벌 또는 지역화된 스트레인 응용 프로그램에 대한 응답으로 하나의 살아있는 자기편 세포에서 유도된 핵 및 cytoskeletal deformations을 측정하기 위해 두 개의 독립적인, 현미경 기반의 도구를 제시한다. 이러한 기술은 핵 강성 (즉, deformability)을 확인하고 핵과 cytoskeleton 세포 사이에 강제로 전송을 탐사하는 데 사용됩니다.

계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 Biophysical Assays : 기판 스트레인 신청 및 Microneedle 조작

대부분의 진핵세포에서 핵은 가장 큰 세포소기관이며, 일반적으로 주변 세포골격보다 2배에서 10배 더 뻣뻣합니다. 결과적으로...

다음 실험들의 전반적인 목적은 인터페이스 세포핵의 기계적 특성과 주변 세포골격과의 물리적 연결성을 측정하는 것입니다. 이는 투명한 실리콘 막 위에 배양된 세포에 기계적 변형(strain)을 가하고, 이에 의해 유도된 핵의 변형을 이미징함으로써 수행됩니다. 핵의 변형이 증가할수록 핵의 강성(stiffness)은 감소하는 것에 해당하며, 핵과 세포골격 간 결합의 변화 또한 유도된 핵 변형에 영향을 미칠 수 있습니다.세포골격에 국소적인 변형을 가하여 세포골격과 핵 사이의 세포 내 힘 전달을 직접적으로 조사합니다. 이후 형광 표지된 NU 핵 및 세포골격 구조의 변위를 이미지화합니다. 이를 통해 주변 세포골격 대비 세포핵의 강성을 나타내는 결과를 얻습니다.기질 변형 실험을 바탕으로 한 마이크로니들 조작 분석 결과, 핵-세포골격 결합의 붕괴가 세포 내 힘 전달의 결함을 유발한다는 것이 밝혀졌습니다. 분리된 핵의 마이크로 피펫 흡입과 같은 기존 방법과 비교하여 이러한 기술의 주요 장점은, 정상적인 세포 구조를 방해하지 않고 온전한 살아있는 세포 내에서 핵 역학을 측정할 수 있다는 점입니다. 이러한 방법들은 핵막 조성의 변화가 핵의 기계적 특성에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.이들은 또한 LA 신경병증이나 암과 같은 질환의 맥락에서 핵 역학의 역할을 연구하는 데 적용될 수 있습니다. 각 인장 디쉬는 직경 3인치의 맞춤 제작된 바닥 없는 플라스틱 디쉬와 세포 배양 기질 역할을 하는 실리콘 막을 고정하기 위한 플라스틱 O-링으로 구성됩니다. 인장 디쉬를 준비하려면 4인치 x 4인치 크기의 실리콘 막 조각을 O-링과 디쉬 사이에 고정하고, 초과하는 막 부분을 조심스럽게 잘라낸 뒤, 탈이온수로 인장 디쉬를 헹구고, 실리콘 막을 세포외 기질 분자로 코팅하기 전에 디쉬를 오토클레이브 처리하며, 막의 하단 중앙 외부 지점에 기준점을 표시합니다.이 랜드마크는 단축 변형 적용을 위한 변형 실험 중에 동일한 세포를 식별하는 데 도움이 됩니다. 기준점 주변에 스카치테이프를 두 줄의 평행한 띠 형태로 붙여 막 형성이 한 방향으로만 이루어지도록 제한합니다. 최적의 세포 부착을 위해 실리콘 막을 3 µg/mL의 fibronectin 또는 적절한 세포외 기질 단백질로 코팅하십시오.스트레인 디쉬를 뒤집은 10 centimeter 폴리스티렌 디쉬로 덮고, 다음 날까지 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 과잉 단백질을 제거하기

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 셀 강성을 측정 할 수있는 빠르고 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법의 일반적인 원리는 세포 표면에 micropipette를 통해 적용 잘 정의 된 부정적인 압력에 대한 응답으로 막 변형을 측정하는 것입니다. 이 방법은 기판에 연결된 세포의 biomechanical 속성을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.

기판에 연결된 전지의 Micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해

이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

우리는이 문서에서 복잡한 이방성 축 기계적 변형에 하나의 세포 반응을 조사하고 생체 조직의 기계적 특성을 정량화하는 데 사용할 수있는 새로운 스트레칭 플랫폼을 제시한다.

세포와 조직 Mechanobiology의 응용 프로그램에 대한 새로운 스트레칭 플랫폼

Described는 부착 세포와 미세 구조 기질 사이의 기계적 상호 작용을 정량화하기 위한 프로토콜입니다. 이러한 상호 작용은 이동, 증식, 분화 및 세포사멸을 포함한 필수 세포 행동과 밀접하게 연결되어 있습니다. 이 프로토콜은 MechProfiler라는 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어를 제공하며, 이를 통해 각 마이크로포스트에 관련된 힘을 결정할 수 있습니다.

Micropost 배열에 쉽고 정확한 - 기계 프로파일

이 프로토콜에서 우리가 직접 살아있는 세포에서 핵을 제어 힘을 적용 하는 micropipette 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 생활, 부착 세포에서 핵 기계적 특성의 심문 수 있습니다.

핵과 골격 사이 기계적인 통합을 측정 하기 위한 직접적인 힘 프로브

이전에 설계 된 장치를 사용 하 여 부착 세포에 기계적 변형을 적용 하는이 백서는 새롭게 디자인 된 하 층 구조와 100 배 오일 침 지 대물 렌즈를 사용 하 여 변형 된 셀의 고해상도 단일 셀 이미징을 위한 맞춤형 장치를 설명 합니다.

일축 인장 스트레인 하에서 살아있는 세포의 핵 역학에 대 한 고해상도 이미징

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

우리는 세포 생존력, 증식 및 탄력성 측정 측면에서 배달 후 조사의 후유증과 결합 된 바늘이없는 워터젯 기술을 통한 세포 주입 방법을 제시합니다.

워터젯 기술을 통한 돼지 지방 조직 유래 스트로마 세포 주입

이 연구는 세포질로 전달되는 자기 마이크로 비드를 통해 세포핵에 기계적 힘을 직접 적용하고 동시 살아있는 세포 형광 이미징을 수행하는 새로운 프로토콜을 제시합니다.

3D 자기력 액추에이터와 다기능 형광 이미징을 결합하여 핵 역학 연구

여기에 제시된 것은 mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)라고하는 전자 기반 미세 유체 플랫폼을 사용하여 단일 세포를 기계적으로 표현형하는 방법입니다. 이 플랫폼은 1-10 cells/s의 적당한 처리량을 유지하면서 세포의 탄성 및 점성 생물물리학적 특성을 모두 측정합니다.

Mechano-Node-Pore 감지: 다중 파라미터 단일 셀 점탄성 측정을 위한 신속한 무표지 플랫폼

기계적 스트레스 하에서의 세포 거동에 대한 탐구는 세포 역학 및 기계생물학의 발전에 중추적인 역할을 합니다. 당사는 단일 세포에서 세포 내 신호의 포괄적인 분석과 제어된 기계적 자극을 결합하는 새로운 방법인 형광 마이크로피펫 흡인(fMPA) 기법을 소개합니다. 이 기술은 살아있는 세포 기계생물학에 대한 새로운 심층 연구를 조사합니다.

적혈구 메카노센싱을 조사하기 위한 형광 마이크로피펫 흡인 분석

배우세요 기판 스트레인 및 마이크로니들 조작을 활용한 계면 세포 핵의 기계적 성질 측정 방법을 통해 세포 핵 경도와 세포골격 간 힘 전달 메커니즘을 분석하는 생물물리학 기법을 익히세요.

계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 Biophysical Assays : 기판 스트레인 신청 및 Microneedle 조작

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