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면역학
0 조회수 • 4:18 분 • July 8th, 2025
뚜렷한 분화 단계에서 신경 전구세포로 구성된 신경 발생 부위인 해마 치상회로 구성된 쥐 뇌 절편을 예로 들어 보겠습니다.
섹션을 투과화 차단 용액으로 옮깁니다. 용액의 세제 분자는 세포를 투과화하는 반면 단백질은 비특이적 결합 부위를 차단합니다.
특정 신경 발생 마커, 미세소관 관련 단백질 및 중간 필라멘트 단백질을 표적으로 하는 1차 항체 칵테일을 추가합니다.
결합되지 않은 항체를 제거합니다. 1차 항체에 결합하는 다양한 형광단 표지 2차 항체를 도입합니다.
1차 항체 중 하나로 동일한 숙주의 혈청 단백질을 추가하여 2차 항체의 파라토프를 포화시킵니다.
혈청 단백질의 에피토프를 포화시켜 비특이적 결합을 방지하는 1가 Fab 단편을 도입합니다.
다른 중간 필라멘트 단백질에 결합하는 두 번째 동일숙주 발생 1차 항체를 추가합니다.
2차 1차 항체를 표적으로 하는 형광단 표지 2차 항체를 도입합니다.
형광 현미경을 사용하여 고유한 마커 조합을 발현하는 신경 전구 하위 유형을 식별합니다.
미세한 브러시를 사용하여 부동액에서 TBS로 섹션을 옮기는 것부터 시작하십시오. 섭씨 4도에서 하룻밤 세척을 시작으로 실온에서 10분 동안 5회 세척하여 절편을 철저히 헹굽니다. 이러한 모든 배양은 지속적으로 부드럽게 교반하면서 수행되어야 합니다.
관심 항원 중 하나가 티미딘 유사체인 경우, 이 시점에서 염산 변성 단계를 구현한 다음 붕산염 완충액에서 중화 단계를 구현해야 합니다. TBS-plus에서 비특이적 항체 결합 부위의 투과화 및 차단을 진행합니다. 이 배양을 실온에서 1시간 동안 그대로 두십시오.
그런 다음 섭씨 4도에서 밤새 TBS-plus에 희석된 첫 번째 1차 항체에서 배양합니다. 다음날 TBS에서 세 번, TBS-T에서 한 번 절편을 세척합니다. 각 목욕을 10분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 첫 번째 형광색소 접합 2차 항체에서 실온에서 3시간 동안 배양합니다. 이제부터는 빛 노출로부터 섹션을 보호하십시오.
또 다른 세척 시리즈 후, 절편을 2개의 1차 항체가 만들어진 10% 숙주 종 혈청 용액으로 옮깁니다. 이 용액에서 절편을 3시간 동안 배양하여 첫 번째 2차 항체의 열린 파라토프를 포화시킵니다. 나중에 TBS에서 세 번 헹구고 TBS-T에서 한 번 헹구어 세럼을 제거합니다.
그런 다음 1차 항체의 숙주 종에 대한 비접합 1가 Fab 단편 밀리리터당 50마이크로그램이 포함된 TBS-plus 용액을 준비합니다. 이것은 두 번째 2차 항체에 의해 인식될 수 있는 에피토프를 포함합니다. 절편을 이 용액으로 옮기고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.
배양 후 절편을 TBS에서 최소 3회, TBS-T에서 1회 헹구십시오. 이송하는 동안 종이 타월에 섹션이 포함된 메쉬 인서트를 면봉으로 닦아 잔여 Fab 잔여물을 제거합니다. 이제 2차 1차 항체의 절편을 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.
또 다른 세척 연속 후, 두 번째 2차 항체를 실온에서 3시간 동안 도포합니다. 마지막으로 TBS에서 절편을 세 번 세척하고 젤라틴에 절편을 장착합니다. 슬라이드를 자연 건조시키고 퇴색 방지 마운팅 매체를 사용하여 커버슬립합니다.