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면역학
0 조회수 • 3:43 분 • July 8th, 2025
고정된 쥐 신장을 가져 가십시오. 조직의 지질은 빛 산란을 일으키고 색소는 빛 흡수를 일으켜 세포를 불투명하게 만듭니다.
탈지질 및 탈색을 위해 CUBIC-L로 조직을 처리합니다. CUBIC-L의 아미노 알코올은 지질과 색소를 제거하여 빛 산란을 최소화하고 투명도를 높입니다.
CUBIC-L의 세제 분자는 또한 세포를 투과화합니다.
교감 신경의 뉴런에서 세포질 티로신 하이드록실라제와 혈관 평활근 세포의 알파-평활근 액틴에 결합하는 1차 항체 칵테일을 도입합니다.
1차 항체에 결합하는 형광단 표지 2차 항체를 추가합니다.
항체 처리를 보존하기 위해 조직 사후 고정을 수행합니다.
물을 대체하고 단백질의 굴절률과 일치하는 CUBIC-R+에 조직을 담그면 빛 산란을 더욱 최소화하고 투명도를 높일 수 있습니다.
라이트 시트 형광 현미경에서 라이트 시트는 조직을 비추어 형광단을 자극합니다.
형광단에서 방출되는 빛을 포착하고 3차원 이미지를 재구성하여 신장 동맥 주변의 교감신경 분포를 표시합니다.
시작하려면 관류 고정 직후 신장을 섭씨 4도에서 4% 파라포름알데히드에 16시간 동안 담가 신장 샘플링을 수행합니다. PBS를 사용하여 각각 2시간 동안 세 번 세척합니다. 고정된 신장을 14밀리리터의 둥근 바닥 튜브에 50% CUBIC-L 7밀리리터에 담그고 실온에서 부드럽게 흔들어 탈색 및 탈지질 과정을 수행합니다.
6시간 후, 섭씨 37도에서 부드럽게 흔들면서 섭씨 37도에서 부드럽게 흔들면서 14mm 바닥 튜브에 7밀리리터의 CUBIC-L에 신장을 담그십시오. CUBIC-L을 매일 새로 고치십시오. 탈색 및 탈지질이 완료되면 샘플 처리를 위해 분배 스푼을 사용하고 실온에서 2시간 동안 PBS로 신장을 세 번 세척합니다.
염색 완충액에 희석한 1차 항체에서 지질화된 신장을 섭씨 37도의 인큐베이터 셰이커에서 7일 동안 부드럽게 흔들어 면역염색합니다. 그런 다음 PBST라고도 알려진 PBS의 0.5% Triton X-100으로 신장을 실온에서 하루 동안 세척합니다. 2차 항체 염색의 경우, 어두운 곳에서 염색 완충액에 2차 항체를 넣고 섭씨 37도에서 7일 동안 부드럽게 흔들어 신장을 처리합니다. 실온에서 하루 동안 PBST 세척으로 얼룩을 고정합니다.
고정 후 신장을 PB의 1% 포름알데히드에 3시간 동안 담그고 실온에서 PBS로 6시간 동안 세척합니다. 14밀리리터 둥근 바닥 튜브에 신장을 50% CUBIC-R+ 7밀리리터에 담그고 하루 동안 흔들면서 굴절률 매칭을 수행한 후 실온에서 2일 동안 흔들면서 CUBIC-R+ 7밀리리터로 치료합니다.