0 조회수 • 4:09 분 • July 8th, 2025
파킨슨병 환자의 피부 생검을 포매 배지에 담아 냉동 절제합니다.
조직은 가장 바깥쪽 표피, 밑에 있는 진피, 신경에 의해 지배되는 피하 지방으로 구성됩니다.
절편을 세척하여 포매 배지를 제거합니다. 이를 투과화 차단 용액으로 옮겨 세포를 투과화하고 비특이적 결합 부위를 차단합니다.
절편을 1차 항체 칵테일에 담가 자유 부동 염색이라고 하는 균일한 항체 라벨링을 달성합니다.
항체는 뉴런에 들어가 축삭을 따라 분포된 알파-시누클레인 응집체(신경퇴행성 질환의 특징적인 응집된 형태)와 카르복실 말단 가수분해효소에 결합합니다.
1차 항체에 결합하는 형광단 접합 2차 항체를 도입합니다.
핵을 염색하는 형광 DNA 결합 염료로 처리합니다.
티슈를 슬라이드 위에 놓고 장착 매체를 바르고 커버슬립으로 밀봉합니다.
공초점 현미경에서 두 항체의 형광은 진피 뉴런의 축삭을 따라 알파-시누클레인 응집체의 존재를 나타냅니다.
시작하려면 신선한 96웰 플레이트의 웰 중 일부를 100마이크로리터의 세척액으로 채웁니다. 분석할 섹션을 저장 플레이트에서 세척액이 들어 있는 섹션으로 옮깁니다. 절편을 실온에서 10분 동안 세척액에 그대로 두십시오. 그런 다음 각 섹션을 동일한 세척액이 들어 있는 빈 우물로 옮기고 세척을 반복합니다. 그런 다음 절편에 세척액을 추가하고 100마이크로리터의 차단 용액이 들어 있는 새 웰로 옮깁니다. 실온에서 최소 90분에서 최대 4시간 동안 배양합니다.
작업 용액에서 1차 항체, 항-PGP9.5 및 항-5G4를 희석합니다. 1차 항체의 작업 용액 100마이크로리터가 들어 있는 새 웰에 절편을 옮기고 실온에서 밤새 배양합니다.
다음날, 앞서 설명한 대로 세척액이 들어 있는 우물에서 절편을 세척하십시오. 2차 항체를 희석합니다 - 염소 항토끼는 항-PGP9.5를 검출하고 염소 항마우스는 작업 용액에서 5G4를 검출합니다.
세척된 절편을 2차 항체의 작동 용액 100마이크로리터가 들어 있는 새 웰로 옮깁니다. 2차 항체와 접합된 형광단의 표백을 방지하기 위해 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 실온에서 90분 동안 배양합니다.
그런 다음 앞서 설명한 대로 세척액으로 절편을 두 번 세척하십시오. 세척된 절편을 실온에서 5분 동안 100마이크로리터의 DAPI가 들어 있는 새 웰에 옮깁니다. 앞서 설명한 대로 세척액으로 절편을 두 번 세척하십시오. 그런 다음 잘못 접히지 않도록 슬라이드의 올바른 위치에 섹션을 장착합니다.
슬라이드에 장착 매체 몇 방울을 추가하고 커버슬립으로 섹션을 덮습니다. 슬라이드를 밤새 말리십시오. 다음날 슬라이드를 섭씨 4도의 적절한 상자에 보관하고 빛 노출을 피하십시오.
도립 형광 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 섹션을 봅니다. 현미경에 연결된 카메라로 이미지를 획득합니다. 그런 다음 형광 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 신호의 공간 분포 및 강도 측면에서 섹션의 양성 신호를 분석합니다.