장기 수혜자에서 항공여자 HLA 동종항체의 펩타이드 어레이 기반 검출

장기 기증자의 인간 백혈구 항원 또는 셀룰로오스 막에 서로 다른 펩타이드를 포함하는 HLA 서열에서 파생된 펩타이드 어레이를 취하십시오.

각 펩타이드는 기증자와 수혜자 HLA 서열 사이에 적어도 하나의 아미노산 불일치를 가지고 있으며, 이는 항체 매개 장기 거부반응에 대한 잠재적인 에피토프를 나타냅니다.

비특이적 항체 상호작용을 방지하기 위해 차단 완충액으로 처리합니다.

동종항체를 포함하는 장기 이식 후 수집된 수혜자 혈청을 추가합니다.

기증자의 HLA에 대해 형성된 이러한 항체는 표적 에피토프에 결합합니다.

동종항체에 결합하는 과산화효소 접합 2차 항체를 추가합니다.

화학발광 기질과 과산화수소를 첨가합니다. 과산화효소는 과산화수소를 사용하여 기판을 산화시켜 빛을 방출합니다.

멤브레인을 스캔하여 이미지를 얻습니다.

결합된 항체를 벗겨내기 위해 완충액을 추가합니다. 이식 전 수혜자 혈청으로 재조사하고 이미지를 얻습니다.

이식 전 이미지와 비교하여 이식 후 이미지의 어두운 반점은 동종항체 반응성을 유발하는 기증자 특이적 HLA 에피토프를 나타냅니다.

어레이가 합성되면 0.1% Tween 20 또는 TBST가 포함된 트리스 완충 식염수에 용해된 5% 탈지 우유 20밀리리터로 멤브레인을 적절한 배양 기간 동안 차단합니다. 다음으로, 20밀리리터의 신선한 TBST로 멤브레인을 세척당 5분 동안 3회 세척한 후 20마이크로리터의 조수혜자 혈청과 함께 TBST의 2.5% 우유에 실온에서 2-3시간 동안 배양합니다.

배양이 끝나면 멤브레인을 세척당 10분 동안 3회 세척하고 염소 항인간 양 고추냉이 과산화효소 접합 IgG 2차 항체와 함께 멤브레인을 2시간 동안 배양합니다.

TBST에서 10분 동안 세 번 세척하여 결합되지 않은 2차 항체를 제거하고 새로 준비된 루미놀 용액 5밀리리터와 과산화물 용액 5밀리리터에 멤브레인을 현상시킵니다. 1분 후, 적절한 이미저에서 향상된 화학발광 신호를 시각화합니다.

현상된 이미지를 저장한 후, 멤브레인을 섭씨 37도에서 20분 동안 20밀리리터의 상업용 스트리핑 완충액과 함께 배양한 후 TBST에서 10분 동안 세 번 세척합니다. 그런 다음 다른 시점에서 얻은 동일한 환자의 혈청 샘플로 방금 시연한 것처럼 막을 차단하고, 다시 조사하고, 시각화합니다.