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면역학
0 조회수 • 4:57 분 • July 8th, 2025
어레이 블록으로 구성된 인쇄된 글리칸 하위 어레이를 특징으로 하는 기능화된 글리코칩으로 시작합니다.
하위 배열의 각 지점은 단당류 구성, 사슬 길이 및 분기 패턴이 변하는 탄수화물 기반 폴리머인 뚜렷한 글리칸을 나타냅니다.
글리코칩을 차단 완충액으로 처리하여 비특이적 상호 작용 부위를 차단합니다.
글리코칩을 옮기고 시면활성제가 보충된 완충액에 희석된 마우스 혈청을 도입하여 항체 응집을 최소화합니다. 교반하면서 배양합니다.
교반은 균일한 혈청 분포를 촉진하여 뚜렷한 분자 특성을 기반으로 항글리칸 항체가 특정 글리칸에 선택적으로 결합하는 것을 촉진합니다.
비특이적 결합을 방해하기 위해 계면활성제 함유 완충액의 농도를 낮추고 세척하고 헹굽니다.
글리코칩에 항마우스 비오틴 접합 2차 항체를 오버레이하고 사전 결합된 항글리칸 항체와 상호 작용하고 세척합니다.
형광단 표지 스트렙타비딘을 도입하여 비오티닐화된 2차 항체에 결합합니다. 여분의 용액을 씻고 제거하십시오.
글리코칩을 스캔하고 혈청에서 글리칸 특이적 순환 항체를 암시하는 다양한 위치에서 뚜렷한 형광 반점을 관찰합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 버퍼 #1을 버퍼 #4까지 준비합니다. 글리코칩과 샘플을 준비하려면 슬라이드가 있는 보관 상자를 실온에 도달할 때까지 테이블 위에 놓습니다. 상자를 열고 글리코칩을 배양실로 옮기고, 배양실은 챔버 내부의 습도를 일정하게 유지하기 위해 이미 젖은 여과지로 컨디셔닝되어야 합니다.
한편, 1.5밀리리터 튜브에 완충액 1로 마우스 혈청을 희석합니다. 와류 혼합기로 혈청 용액을 5초 동안 균질화합니다. 균질화 후, 면역글로불린 응집을 피하기 위해 희석된 혈청을 섭씨 37도에서 수조에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브를 10,000배 g 및 섭씨 25도에서 3분 동안 원심분리합니다.
상층액을 수집하고 침전된 물질을 버립니다. 글리코칩을 배양 챔버에 조심스럽게 넣습니다. 1밀리리터의 완충액 #3과 함께 배양하여 글리코칩 표면의 잔류 물질을 제거합니다. 섭씨 25도에서 15분 동안 글리코칩을 수직 위치에 놓고 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 완충액 #3 몇 방울로 다시 세척합니다.
그런 다음 여과지를 사용하여 글리코칩 표면에서 완충액을 조심스럽게 제거합니다. 글리코칩을 배양 챔버에 다시 넣습니다. 마이크로피펫을 사용하여 희석된 혈청 샘플을 글리코칩 표면에 펴 바릅니다. 피펫 팁을 사용하여 글리코칩 표면의 모든 건조 영역이 희석된 혈청 샘플로 덮여 있는지 확인합니다.
섭씨 37도에서 1시간 1/2시간 동안 안와를 교반하면서 배양합니다. 배양 후, 여분의 샘플을 제거하고 글리코칩을 섭씨 25도의 완충액 #3에 5분 동안 담그십시오. 글리코칩을 완충액 #4가 담긴 용기에 전달하고 마지막으로 글리코칩을 초순수로 세척합니다.
글리코칩을 175배g, 섭씨 25도에서 1분 동안 원 심분리하여 액체를 제거합니다. 글리코칩을 배양 챔버에 다시 넣은 후, 비오틴에 접합된 염소 항마우스 용액을 글리코칩 표면 위에 펴 바릅니다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 궤도 교반과 함께 배양합니다. 결합되지 않은 부분을 제거하고 세척 단계를 반복합니다.
원심분리 후, 감충액 #2에 상응하는 형광색소 표지 스트렙타비딘 용액을 밀리리터당 2마이크로그램으로 섭씨 25도의 어두운 곳에서 45분 동안 글리코칩을 배양합니다. 어둠 속에서 작업하여 결합되지 않은 분획을 제거하고 세척 단계를 반복한 후 글리코칩을 공기로 건조시킵니다.
어레이를 스캔하려면 어둠 속에서 실온에 도달할 때까지 글리코칩을 테이블 위에 그대로 두십시오. 동시에 슬라이드 스캐너와 레이저를 켭니다. 마이크로어레이를 잡고 글리코칩이 뒷면에 닿을 때까지 슬롯에 밀어 넣습니다. Easy Scan을 실행하여 글리코칩을 스캔하고 스캔을 .tiff 파일로 저장합니다.