제브라피시 방사상 신경교세포(Radial Glia progenitor)에서 Notch/DeltaD 신호 전달을 이미징하기 위한 항체 흡수 분석

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가로스에 박힌 융모막화된 제브라피쉬 배아가 있는 배양 접시를 현미경 스테이지 위에 놓습니다.

적색 형광 표지 항체와 항-델타D 항체를 운반하는 저농도의 항체 접합체를 포함하는 염료 용액을 섭취하십시오.

염료 용액을 배아의 후뇌실에 주입하여 활발하게 분열하는 방사형 아교세포 전구 또는 RGP를 표적으로 합니다.

매립된 배아를 풀어주고 영양이 풍부한 배지에서 회수합니다.

회수 중에 형광 접합체는 RGP의 몇 가지 Notch 리간드 DeltaD 분자와 상호 작용하여 내재화 및 엔도좀 형성을 시작합니다.

낮은 접합체 농도는 결합되지 않은 DeltaD 리간드가 Notch 수용체와 상호 작용하여 RGP에서 Notch 신호 전달 경로를 활성화할 수 있도록 합니다.

회복 후, 영상 촬영을 위해 아가로스가 포함된 마취된 배아를 등쪽이 아래를 향하도록 유리 접시에 옮깁니다.

타임랩스 형광 이미징을 수행하여 세포 분열을 캡처하면 DeltaD 함유 형광 엔도좀이 두 개의 딸 세포로 비대칭 분할되어 Notch/DeltaD 신호 전달의 활성화를 확인합니다.

내장된 배아를 실체 현미경 아래에 놓고 아가로스를 계란물로 덮습니다. 미세 매니퓰레이터로 공기압 인젝터를 설정하여 현미경 가까이에 놓습니다. 고압에서 기체 질소를 함유한 강철 가스 실린더를 공기 자원으로 사용하십시오.

배아가 아가로스에 장착되면 가스 밸브를 엽니다. 마이크로인젝터의 전면 충전 모듈을 사용하는 동안 준비된 유리 바늘에 마이크로매니퓰레이터에 2마이크로리터의 항체 혼합물을 전면으로 로드합니다. 이제 입력 압력을 평방 인치당 80-90파운드로, 사출 압력을 평방 인치당 20파운드로 조정합니다.

현미경 아래에서 마이크로미터를 사용하여 주입량을 보정합니다. 바늘 개구부의 크기에 따라 조정 시간을 10밀리초에서 120밀리초로 설정합니다. 페달을 눌러 각 주입 펄스를 전달하고 각 전달의 주입량을 4-5나노리터로 조정합니다.

그런 다음 미세주사 바늘의 끝을 마름모꼴 0/1 힌지 포인트 뒤쪽의 후뇌 등쪽 지붕판을 통해 찔러 뇌 조직에 닿지 않고 약 10나노리터의 항체 혼합물을 주입합니다. 뇌실에서 붉은 체액이 흐르는 것을 관찰하십시오.

주사 후 마이크로매니퓰레이터의 손잡이를 돌려 배아에서 바늘 끝을 빠르게 제거합니다. 성공적인 주입을 위해 주입된 혼합물의 적색 염료는 주변의 아가로스로 누출되지 않고 뇌실에 안정적으로 남아 있습니다. 현미경 아래에서 장착 플레이트를 이동하여 반복에 적