0 조회수 • 3:38 분 • July 8th, 2025
다양한 식물 조직의 얇은 부분을 포함하는 반응 우물이 있는 슬라이드를 가져갑니다. 조직은 면역염색을 위해 수지 내부에 고정되고 내장됩니다.
슬라이드를 어둡고 습한 배양 챔버 안에 놓아 후속 단계에서 빛 노출 및 시약 증발을 방지합니다.
비특이적 항체 상호작용을 방지하기 위해 차단 용액을 도입합니다.
세척하여 과도한 차단 용액을 제거한 다음 항원 특이적 1차 항체를 추가하고 배양합니다.
항체는 표적 항원, 즉 세포벽의 아라비노갈락탄 단백질과 펙틴에 결합합니다.
1차 항체에 결합하는 형광단 접합 2차 항체를 도입합니다.
결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척하고 셀룰로오스에 결합하는 형광 염료를 도포하여 세포벽을 표지합니다.
마운팅 매체를 추가하고 커버슬립으로 밀봉합니다.
현미경으로 보면 염료와 결합된 항체의 형광은 아라비노갈락탄 단백질 또는 펙틴과 함께 국소된 식물 세포벽의 셀룰로오스를 시각화하는 데 도움이 되어 조직 특이적 분포를 나타냅니다.
반응 슬라이드를 위한 배양 챔버를 준비하려면 피펫 팁 상자 바닥에 적신 종이 타월을 놓고 상자를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 상자에서 배양 챔버로 슬라이드를 옮깁니다. 각 웰에 50마이크로리터의 차단 용액을 피펫팅합니다. 슬라이드를 10분 동안 배양한 후 차단 용액을 제거합니다. 그런 다음 모든 웰을 PBS로 매번 10분 동안 두 번 세척합니다. 원고에 설명된 대로 1차 항체 용액을 준비한 후, 증류된 탈이온수로 웰을 5분 동안 최종 세척합니다.
1차 항체 용액을 반응 웰에 피펫팅합니다. 그런 다음 차단 용액을 제어 웰에 피펫팅합니다. 배양실을 닫습니다. 실온에서 2시간 동안 그대로 두었다가 섭씨 4도에서 밤새 냉장 보관합니다. 차단 용액에 2차 항체의 1% 용액을 준비합니다. 웰당 약 40마이크로리터가 필요합니다.
용액을 알루미늄 호일로 덮으십시오. 반응 슬라이드의 웰을 PBS로 두 번 세척하고 증류된 탈이온수로 매번 10분 동안 한 번 세척합니다. 우물에 막힘 용액이나 침전물이 남아 있지 않은지 확인하십시오. 2차 항체 용액을 모든 웰에 피펫팅합니다. 슬라이드를 실온에서 어둠 속에서 3-4시간 동안 배양합니다.
다시 반응 슬라이드의 웰을 PBS로 두 번 세척하고 증류된 탈이온수로 한 번 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 칼코플루오르-화이트 한 방울을 추가합니다. 세척하지 않고 각 웰에 설치 매체 한 방울을 추가하고 각 웰을 커버슬립으로 덮습니다. 형광 현미경을 사용하여 반응 슬라이드의 샘플 섹션을 관찰합니다.
각 관찰에 대해 UV 필터를 사용하여 칼코플루어에 의해 염색된 세포벽을 검출하고 FITC 필터를 사용하여 면역국소화를 검출합니다. 결과를 더 잘 시각화하려면 ImageJ 또는 유사한 이미지 분석 프로그램을 사용하여 각 UV 필터 이미지를 해당 FITC 필터 이미지와 병합하십시오.