샌드위치 ELISA를 사용하여 백신의 면역원성 당단백질 함량 측정

견병, 면역원성 당단백질 특이적 단클론 항체 및 비특이적 상호 작용을 방지하기 위한 차단제로 코팅된 부동태화 분석 플레이트로 시작합니다.

당단백질 함량이 감소하는 연속적으로 희석된 참조 및 테스트 광견병 백신을 도입합니다. 오염을 방지하기 위해 플레이트를 밀봉하십시오.

배양하는 동안 면역원성 당단백질은 특정 항원 부위를 통해 코팅된 단클론 항체와 상호 작용합니다.

배양 후 필름을 제거하고 상청액을 흡인한 다음 플레이트를 세척합니다.

당단백질의 다른 항원 부위에 결합하여 면역복합체를 형성하는 효소 접합 당단백질 특이적 단클론 항체와 오버레이합니다.

기질과 발색원을 포함하는 용액을 추가합니다. 기질이 효소와 상호 작용하면 발색원의 산화가 발생하여 용액 색상이 변합니다.

효소를 비활성화하기 위해 중단 용액을 추가합니다.

흡광도를 측정하고 참조 백신 값을 사용하여 참조 곡선을 생성합니다.

흡광도와 참조 백신 희석액의 당단백질 함량 사이에 선형 관계가 있는 영역을 식별합니다. 그런 다음 이 영역에 속하는 흡광도를 기준으로 테스트 백신 희석액의 당단백질 함량을 추정합니다.

블레이드를 세척하려면 각 웰에 300마이크로리터의 세척 완충액을 추가합니다. 그런 다음 조심스럽게 흡인하고 웰 내용물을 2.6% 차아염소산나트륨 용액이 들어 있는 수용자로 옮깁니다. 이 세척 과정을 5회 더 반복하여 감작된 플레이트를 광범위하게 세척합니다.

그런 다음 마이크로플레이트를 뒤집고 흡수성 종이 위에 실온에서 1분 동안 건조시킵니다. 광견병 바이러스 당단백질의 최종 농도가 밀리리터당 10마이크로그램이 되도록 참조 백신을 증류수 1밀리리터에 재구성합니다. 희석액에 재구성된 참조 백신의 10배 희석액을 준비하여 밀리리터당 1마이크로그램의 광견병 바이러스 당단백질 농도에 도달합니다.

다음으로, 텍스트 프로토콜의 표 1에 설명된 대로 희석제에서 이 참조 백신의 6회 연속 2배 희석을 수행합니다. 빈 대조군 역할을 하기 위해 200마이크로리터의 희석액을 이중으로 분배하고, 각 참조 백신 희석액에 대해 웰당 200마이크로리터를 이중으로 분배합니다.

그런 다음 희석액에서 시험된 백신의 10배 희석액을 준비하고, 텍스트 프로토콜의 표 2에 설명된 대로 희석액으로 시험된 백신의 7배 연속 희석액을 준비합니다. 테스트된 각 백신 희석액 200마이크로리터를 마이크로플레이트의 각 웰에 이중으로 분배합니다. 마이크로플레이트를 접착 필름으로 덮고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 필름을 제거하고 조심스럽게 흡인한 다음 각 웰의 내용물을 2.7% 차아염소산나트륨 용액이 들어 있는 수용자로 옮깁니다. 플레이트를 세척하려면 각 웰에 300마이크로리터의 세척 완충액을 추가합니다. 조심스럽게 흡인하고 각 웰의 내용물을 2.6% 차아염소산나트륨 용액이 들어 있는 수용자로 옮깁니다.

결합되지 않은 항원을 제거하기 위해 세척 과정을 5회 더 반복합니다. 코팅된 항체에 결합된 G-단백질 삼량체를 보존합니다. 세척된 마이크로플레이트를 뒤집고 흡수성 종이 위에 실온에서 1분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 희석액에 있는 과산화효소 표지 D1 단클론 항체의 권장 희석액 200마이크로리터를 각 웰에 분배합니다.

마이크로플레이트를 접착 필름으로 덮고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 필름을 제거하고 조심스럽게 흡인한 다음 각 웰의 내용물을 2.6% 차아염소산나트륨 용액이 들어 있는 수용자로 옮깁니다. 마이크로플레이트를 세척하려면 각 웰에 300마이크로리터의 세척 완충액을 추가합니다.

심스럽게 흡인하고 각 웰의 내용물을 2.6% 차아염소산나트륨 용액이 들어 있는 수용자로 옮깁니다. 이 세척 과정을 5회 더 반복하여 결합되지 않은 과산화효소 표지 항체를 제거합니다. 세척 마이크로플레이트를 뒤집고 흡수성 종이 위에 실온에서 1분 동안 건조시킵니다.

다음으로, 200마이크로리터의 기질 발색원 용액을 각 웰에 분배합니다. 마이크로플레이트를 필름으로 밀봉하고 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 각 웰에 50마이크로리터의 정지 용액을 첨가하여 반응을 중지합니다.

마이크로블레이드의 바닥을 조심스럽게 닦고 분광 광도계에 넣습니다. 사용된 모든 웰에 대해 492나노미터에서 광학 밀도를 결정합니다. 분석을 위해 이 데이터를 스프레드시트 파일로 수집합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 참조 백신 곡선과 광학 밀도 값 모두에 대한 플롯을 생성합니다.