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면역학
0 조회수 • 3:39 분 • July 8th, 2025
자연적인 세포외 기질 환경을 모방한 하이드로겔 시스템에 캡슐화된 포유류 세포가 들어 있는 멀티웰 플레이트를 가져 와서 보십시오.
배양 배지를 제거합니다. 고정 완충액으로 처리하여 단백질을 가교하여 세포 무결성을 보존합니다.
세포막을 투과화하기 위해 세제가 함유된 용액을 첨가하십시오.
후속 단계에서 비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 차단 용액을 도입합니다.
세포에 들어가 세포질 중간 필라멘트 및 표적 전사 인자에 특이적으로 결합하는 1차 항체 칵테일을 추가합니다.
결합되지 않은 항체를 제거합니다. 형광 표지된 2차 항체와 핵 염색을 도입하여 DNA를 형광으로 표지합니다.
결합되지 않은 분자를 제거합니다.
마운팅 매체를 사용하여 하이드로겔 배양액을 슬라이드에 마운트합니다.
공초점 현미경을 사용하여 면역염색된 세포를 관찰합니다.
먼저 각 웰에서 배지를 흡인합니다. 그런 다음 따뜻한 DPBS 1밀리리터로 우물을 씻습니다. 세척이 완료되면 각 웰에 750마이크로리터의 고정액을 추가합니다. 그런 다음 24웰 플레이트를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 각 웰에서 고정액을 흡인하고 고정액을 유해 폐기물 용기에 버립니다. 그런 다음 샘플에 DPBS 1밀리리터를 추가하고 즉시 DPBS를 유해 폐기물 용기에 버립니다.
다음으로, 750마이크로리터의 투과용액을 첨가하여 로커의 실온에서 분당 15회전으로 1시간 동안 샘플을 투과화합니다. 1시간 후, 투과화 용액을 흡인하고 750마이크로리터의 차단 용액을 샘플에 첨가합니다. 샘플을 실온에서 3시간 동안 로커에 그대로 둡니다. 그런 다음 원하는 1차 항체를 항체 희석 용액으로 희석합니다.
다음으로, 각 샘플에 500마이크로리터의 항체 용액을 추가합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음날 1차 항체 용액을 흡인합니다. 그런 다음 실온에서 분당 15회전으로 PBST로 1시간 동안 세 번 샘플을 세척합니다.
다음으로, 적절한 2차 항체와 5mg/ml의 DAPI 원액을 희석하여 밀리리터당 2.5마이크로그램의 최종 농도를 달성합니다. 그런 다음 각 샘플에 500마이크로리터의 용액을 추가합니다. 그런 다음 알루미늄 호일을 사용하여 24웰 플레이트를 덮고 플레이트를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.
다음날, 2차 항체 용액을 흡인하고 샘플을 PBST로 로커에서 실온에서 30분 동안 세 번 세척합니다. 다음으로, 유리 슬라이드 표면에 하드 세트 마운팅 매체 한 방울을 놓고 샘플을 마운팅 매체 위에 놓습니다. 마지막으로 매니큐어를 사용하여 샘플을 유리 커버 슬라이드에 밀봉하여 오염이나 샘플 이동을 방지합니다.