바이러스 유래 펩타이드 변형 항체 접합체의 세포 내 분포 평가

부착된 인간 적혈구 세포로 시작합니다.

바이러스 유래, 펩타이드 변형 항체 접합체를 도입합니다. 이러한 접합체에는 바이러스의 핵 국소화 서열(NLS)과 콜산 잔기가 포함되어 있습니다.

배양하는 동안 항체 접합체는 세포 표면 수용체와 상호 작용하고 엔도좀 내에서 내재화됩니다.

접합체의 콜산은 엔도좀 구획을 탈출하는 데 도움을 주어 세포내 축적을 가능하게 하는 반면, 수송 단백질과 NLS는 핵 국소화를 촉진합니다.

트립신과 EDTA 함유 완충액을 도입하여 세포를 분리하고 표면 결합 접합체를 제거합니다.

트립신 활성을 억제하기 위해 혈청이 풍부한 배지를 첨가하십시오.

원심분리하여 세포를 수집합니다. 고정하고 투과시킵니다.

원적외선 형광단 표지 2차 항체를 도입하여 국소 접합체에 결합하고 세척합니다.

핵 염색 염료로 처리하십시오.

공초점 현미경으로 관찰하고 다양한 평면 깊이에서 이미지를 캡처합니다.

이미지 처리 후 세포는 세포질과 핵 내부에 작은 녹색 형광 병소를 보여 항체 접합체의 세포내 분포를 확인합니다.

표적 TF-1a 세포를 200나몰 7G3-콜산-항체 접합체로 처리합니다. 변형된 대조군 단클론 항체로 처리된 세포를 포함합니다. 5 x 10⁶ 항원 양성 세포를 접합체와 함께 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 상청액을 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS 1밀리리터를 사용하여 세포를 세 번 세척합니다.

신선한 배지를 추가하고 세포를 섭씨 37도에서 추가로 한 시간 동안 배양합니다. 다음으로, 0.25% 트립신과 EDTA를 함유한 PBS 0.5밀리리터를 첨가하고, 세포를 섭씨 37도에서 최대 30분 동안 배양한다. 그런 다음 10% FBS가 함유된 RPMI-1640 배지 1.5밀리리터를 사용하여 트립신을 중화합니다.

세포를 500배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS 0.5밀리리터를 사용하여 세포를 다시 세 번 세척합니다. PBS에 1% PFA 및 1% 자당 0.5밀리리터를 세포에 넣고 얼음 위에 30분 동안 놓아 고정시킵니다.

그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS 0.5밀리리터를 사용하여 세포를 3회 세척하고 샘플을 250배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 다음으로, PBS에 0.15% Triton X-100을 세포에 첨가하고 얼음 위에서 5분 동안 투과화합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 세척하고 원심분리를 반복합니다.

AlexaFluor 647에 접합된 항쥐 Fc 2차 다클론 항체 밀리리터당 2마이크로그램을 함유한 0.1밀리리터의 PBS에 세포를 현탁시키고, 샘플을 실온에서 1시간 동안 어두운 곳에서 배양합니다. 세포를 250배 g에서 5분 동안 원심분리하고 얼음처럼 차가운 PBS 0.5밀리리터를 사용하여 세포를 3회 세척합니다.

그런 다음 세포를 0.5밀리리터의 PBS에 재현탁합니다. 세포에 요오드화 프로피듐 밀리리터당 10마이크로그램을 첨가합니다. 그런 다음 샘플을 유리 커버슬립으로 덮기 전에 마운팅 매체를 사용하여 1 x 10⁵ 셀을 유리 슬라이드에 장착합니다. Plan Apo 60X 오일 이지 대물렌즈, 개구수 1.42를 사용하여 도립 레이저 스캐닝 공초점 현미경에서 세포를 검사합니다.

488나노미터 아르곤 레이저와 600-650나노미터로 설정된 스펙트럼 스캐닝 프리즘을 사용하여 PI 형광을 감지합니다. AF 647 형광의 경우 633나노미터 헬륨-네온 레이저와 650-700나노미터로 설정된 스펙트럼 스캐닝 프리즘을 사용합니다. P1 및 AF 647에서 전체 셀 두께에 걸쳐 0.5미크론 간격으로 촬영한 2X 라인 평균으로 1024 x 1024 픽셀의 이미지를 순차적으로 수집합니다. 이미지를 Z 투영으로 표시합니다.

세포를 분석하려면 세포질의 세포내 형광이 그룹화되어 세포 표면 근처에 있는지 또는 확산되고 균질한지 평가하고 기록합니다. 또한 세포당 상대 형광 강도를 평가합니다.