식세포에 의한 항체 의존성 세포 식세포작용을 측정하기 위한 시험관 분석

관심 항원에 접합된 형광 표지된 마이크로스피어를 가져 가십시오. 고정화된 항원은 항원 특이적 항체에 결합합니다.

비식세포 림프구, 식세포 과립구 및 단핵구를 포함한 백혈구를 추가합니다. 생리학적 조건에서 혼합물을 배양합니다.

고정화된 항체의 Fc 영역은 식세포의 Fc 수용체에 결합하여 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP)을 유발합니다.

원심분리하여 세포를 펠릿화하고 내재화되지 않은 마이크로스피어를 포함하는 상청액을 버립니다.

죽은 세포에 들어가는 생존율 염색을 추가하여 형광 표지합니다.

원심분리하여 세포를 펠릿화하고 상청액을 제거합니다.

백혈구에 결합하는 형광 표지 항체를 추가합니다.

원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 고정합니다.

유세포 분석을 사용하여 먼저 생존율 염색에 대해 양성인 죽은 세포를 제거합니다.

그런 다음 생존 가능한 백혈구를 선택하고 과립구, 단핵구 및 림프구의 입도와 산란 특성에 따라 구별합니다.

마이크로스피어 양성 식세포 세포의 형광 강도를 측정하여 ADCP 활성을 정량화합니다.

ADCP 분석의 경우, 최종 원심분리 후 준비된 ADCP 플레이트를 빠르게 뒤집어 상청액을 디캔팅하고, 5 x 10⁴ 모유 세포를 200마이크로리터의 PBS와 BSA에 첨가하여 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.

배양이 끝나면 세포를 원심분리하고 시연된 대로 200마이크로리터의 신선한 PBS에서 펠릿을 두 번 세척합니다. 마지막 세척 후, 고정 가능한 생존율 염색제 밀리리터당 0.5마이크로그램, 웰당 450마이크로그램, PBS 50마이크로리터로 실온에서 빛으로부터 보호된 상태에서 30분 동안 세포를 염색합니다.

배양이 끝나면 시연된 대로 신선한 PBS에서 두 번 세척하기 위해 세포를 펠릿화하고 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 동안 관심 있는 백혈구 마커에 대한 세포를 염색합니다. 배양이 끝나면 원심분리에 의해 세포를 수집하고 세척당 1% BSA와 PBS의 200마이크로리터에서 세포를 두 번 세척합니다.

마지막 세척 후 펠릿을 웰당 200마이크로리터의 0.5% 포름알데히드에 빛으로부터 보호한 실온에서 30분 동안 고정합니다. 세포 샘플의 유세포 분석을 위해 고처리량 플레이트 리더가 장착된 유세포 분석기를 설정하여 175마이크로리터의 샘플을 채취하고 웰당 5,000개의 세포를 수집합니다.

초기 게이팅을 수행하여 정방향 산란 대 측면 산란도에서 이중선과 파편을 제거합니다. 측 산란 대 생존율 염색 플롯을 사용하여