칼슘 지시약 염료를 사용한 T 세포 수용체 유도 칼슘 유입 평가

마우스 T 세포 현탁액으로 시작하여 칼슘 지시 염료인 Indo-1-acetoxymethyl ester를 도입합니다.

염료는 세포에 들어가 세포내 에스테라아제가 아세톡시메틸기를 절단하여 막 불투과성 Indo-1을 형성하며, 이는 칼슘이 없는 형태와 칼슘 결합 형태에서 뚜렷한 형광을 나타냅니다.

Fc 수용체 항체를 추가하여 비특이적 상호 작용 부위를 차단합니다.

형광단 표지 항체를 도입하여 T 세포 하위 집합을 염색합니다.

결합되지 않은 항체를 제거하고 살아있는 세포와 죽은 세포를 차등적으로 염색하는 생존율 염료로 염색합니다.

유세포 분석에서는 먼저 살아있는 세포의 희미한 형광을 검출하고 형광단 태그가 지정된 T 세포를 식별한 다음 이러한 세포 내에서 Indo-1 형광을 측정합니다.

T 세포 수용체 CD3 복합체와 상호 작용하고 T 세포 신호 전달 경로를 활성화하여 세포질로의 칼슘 유입을 유도하는 항-CD3 항체로 치료합니다.

Indo-1 염료는 방출된 칼슘 이온과 상호 작용하여 염료의 형광을 파란색에서 보라색으로 이동합니다.

Indo-1 형광이 칼슘 무함유 상태에서 칼슘 결합 상태로 전환되면 T 세포 수용체 유도 칼슘 유입이 확인됩니다.

시작하려면 50마이크로그램의 Indo-1 AM이 들어 있는 바이알에 50마이크로리터의 DMSO를 추가하여 Indo-1 AM의 마이크로리터당 1마이크로그램을 준비합니다. 원액을 밀리리터당 6마이크로그램의 농도로 적절한 부피의 cRPMI로 희석합니다.

배지를 섭씨 37도의 수조에 넣습니다. 그런 다음 이 배지를 사용하여 미리 준비된 세포 현탁액을 1:1 비율로 희석하여 밀리리터당 5 내지 600만 개의 세포를 얻습니다. 다음으로, 12웰 조직 배양 플레이트에 실험 조건에 따라 웰당 1밀리리터의 세포 현탁액을 추가합니다.

Indo-1 염료 로딩 세포에 EGTA를 첨가하여 칼슘이 없는 Indo-1 AM에 대한 단일 염색 대조군 샘플을 준비합니다. 형광단이나 Indo-1 염료가 없는 생물학적 음성 대조군을 위해 우물을 수리합니다. 유세포 분석기에서 염료 로딩 세포 현탁액에 50마이크로몰 농도의 이오노마이신을 첨가하여 Indo-1 양성 대조군을 준비합니다.

또한 항체 접합 형광단을 사용하여 추가 세포 집단에 대한 단일 염색 대조군을 위한 웰을 준비합니다. 그런 다음 백만 세포당 2마이크로그램의 FC 수용체 차단 항체를 첨가하고 플레이트를 45분 동안 배양하고 15분마다 두드려 세포를 재현탁