칼슘 지시약 염료를 사용한 T 세포 수용체 유도 칼슘 유입 평가

마우스 T 세포 현탁액으로 시작하여 칼슘 지시 염료인 Indo-1-acetoxymethyl ester를 도입합니다.

염료는 세포에 들어가 세포내 에스테라아제가 아세톡시메틸기를 절단하여 막 불투과성 Indo-1을 형성하며, 이는 칼슘이 없는 형태와 칼슘 결합 형태에서 뚜렷한 형광을 나타냅니다.

Fc 수용체 항체를 추가하여 비특이적 상호 작용 부위를 차단합니다.

형광단 표지 항체를 도입하여 T 세포 하위 집합을 염색합니다.

결합되지 않은 항체를 제거하고 살아있는 세포와 죽은 세포를 차등적으로 염색하는 생존율 염료로 염색합니다.

유세포 분석에서는 먼저 살아있는 세포의 희미한 형광을 검출하고 형광단 태그가 지정된 T 세포를 식별한 다음 이러한 세포 내에서 Indo-1 형광을 측정합니다.

T 세포 수용체 CD3 복합체와 상호 작용하고 T 세포 신호 전달 경로를 활성화하여 세포질로의 칼슘 유입을 유도하는 항-CD3 항체로 치료합니다.

Indo-1 염료는 방출된 칼슘 이온과 상호 작용하여 염료의 형광을 파란색에서 보라색으로 이동합니다.

Indo-1 형광이 칼슘 무함유 상태에서 칼슘 결합 상태로 전환되면 T 세포 수용체 유도 칼슘 유입이 확인됩니다.

시작하려면 50마이크로그램의 Indo-1 AM이 들어 있는 바이알에 50마이크로리터의 DMSO를 추가하여 Indo-1 AM의 마이크로리터당 1마이크로그램을 준비합니다. 원액을 밀리리터당 6마이크로그램의 농도로 적절한 부피의 cRPMI로 희석합니다.

배지를 섭씨 37도의 수조에 넣습니다. 그런 다음 이 배지를 사용하여 미리 준비된 세포 현탁액을 1:1 비율로 희석하여 밀리리터당 5 내지 600만 개의 세포를 얻습니다. 다음으로, 12웰 조직 배양 플레이트에 실험 조건에 따라 웰당 1밀리리터의 세포 현탁액을 추가합니다.

Indo-1 염료 로딩 세포에 EGTA를 첨가하여 칼슘이 없는 Indo-1 AM에 대한 단일 염색 대조군 샘플을 준비합니다. 형광단이나 Indo-1 염료가 없는 생물학적 음성 대조군을 위해 우물을 수리합니다. 유세포 분석기에서 염료 로딩 세포 현탁액에 50마이크로몰 농도의 이오노마이신을 첨가하여 Indo-1 양성 대조군을 준비합니다.

또한 항체 접합 형광단을 사용하여 추가 세포 집단에 대한 단일 염색 대조군을 위한 웰을 준비합니다. 그런 다음 백만 세포당 2마이크로그램의 FC 수용체 차단 항체를 첨가하고 플레이트를 45분 동안 배양하고 15분마다 두드려 세포를 재현탁합니다.

배양 후, 플레이트에서 전체 부피의 세포를 혼합하고 제거하고 1.7밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 추가합니다. 상층액을 원심분리하고 디캔팅합니다. 세포를 예열된 cRPMI 1밀리리터로 세척한 후 다시 펠릿화하고 상청액을 디캔팅합니다.

세포를 cRPMI 1밀리리터에 재현탁하고 각 튜브를 배양하고 가스 교환을 위해 튜브 상단을 약간 열어 세포 내 AM 에스테르의 완전한 탈에스테르화를 허용합니다. 다음으로, 모든 사용자 정의 형광색소 접합 항체의 마스터 믹스를 준비하고 세포 부피의 1밀리리터에 대해 휴지 세포에 첨가합니다.

휴식 후 세포를 펠릿화하고 섭씨 4도로 냉각된 cRPMI 1밀리리터에 재현탁하여 펠릿을 세척합니다. 이 단계를 반복하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 캡이 있는 500밀리리터 폴리스티렌 유동관을 사용하여 500마이크로리터의 페놀 레드가 없는 cRPMI에 개별 샘플을 재현탁합니다.

칼슘 플럭스 분석을 사용하여 온도를 유지하려면 작은 수조에 목욕 구슬을 추가하여 구슬 수조를 준비하고 섭씨 37도까지 예열합니다. 50밀리리터 원뿔형 튜브를 조심스럽게 반으로 자르고 튜브 상단을 버립니다. 나머지 튜브의 3/4을 목욕 구슬로 채우고 구슬 목욕에서 섭씨 37도에 도달하도록 합니다.

튜브를 배치하기 위해 스티로폼 선반과 함께 유세포 분석기 근처에 비드 욕조를 놓습니다. 유세포 분석기에서 분석하기 전에 튜브를 개별적으로 섭씨 37도까지 7분 동안 예열합니다. 유세포 분석기 소프트웨어에 로그인하고 라이브러리 탭을 클릭합니다.

그런 다음 형광 태그를 선택하여 칼슘 결합 Indo-1 및 칼슘 프리 Indo-1을 추가합니다. 그런 다음 형광 태그 그룹에서 UV 레이저를 선택하고 플러스 추가를 클릭하여 형광 태그 이름을 추가합니다. 레이저 여기 및 방출 파장을 선택한 다음 저장을 클릭합니다.

실험 설정을 계속 진행합니다. 획득 탭을 클릭합니다. 새 실험을 열거나 만들고 원하는 형광 태그를 실험에 추가합니다. 실험에 대한 참조 그룹과 새 샘플 그룹을 만들고 두 그룹에 레이블을 지정합니다.

획득 탭에서 기록할 이벤트를 최대 1,000만 개로, 정지 볼륨을 최대 볼륨 3,000마이크로리터로, 중지 시간을 최대 36,000초로 설정합니다. 다색 패널에 포함된 사용자 정의 접합 항체 및 Indo-1 기능성 염료에 대한 단일 염색 대조군을 획득합니다.

칼슘 결합 Indo-1 양성 대조군 및 소용돌이에 50마이크로몰의 이오노마이신을 첨가합니다. 플로우 튜브를 샘플 주입 보드에 추가하고 기록을 클릭합니다. 그런 다음 칼슘이 없는 Indo-1 음성 대조군을 유세포 분석기에 추가하고 기록을 클릭합니다.

Unmix 버튼을 클릭하여 단일 스테인드 컨트롤의 믹스를 풉니다. 혼합 해제가 완료되면 샘플에서 파편을 제거하기 위한 SSCA 대 FSCA, 이중항을 제거하기 위한 SSCA 대 SSCH와 같은 혼합되지 않은 워크시트를 사용하여 순차적 플롯을 생성합니다.

그런 다음 플롯을 클릭하여 게이트를 만듭니다. 워크시트에 플롯을 추가하고 게이트 내부를 두 번 클릭하여 다운스트림 게이트 모집단을 만듭니다. 관심 있는 모든 모집단이 설명될 때까지 계속합니다. 다음으로, 순차적 분석을 위해 이전에 준비된 단일 염색 대조군 샘플을 섭씨 37도로 예열합니다.

유세포 분석 소프트웨어를 설정하고 탈이온수를 2-3분 동안 실행하여 유세포 분석기의 유체 안정성을 보장합니다. 다각형, 직사각형 또는 타원 게이트 버튼을 사용하여 관심 모집단 포함을 사용하여 게이트를 생성하여 혼합되지 않은 워크시트에 순차 그림을 설정합니다.

게이트 내부를 두 번 클릭하고 y축 및 x축 매개변수를 SSCA 대 SSCH로 변경합니다. 축을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 축 매개변수 정의를 완료합니다. SSCA 대 생존율 염료 신호로 플롯을 만듭니다. 음성 또는 아민 염료 염색인 살아있는 세포를 게이트합니다.

살아있는 사체 염색에 대해 음성인 살아있는 세포는 y축과 x축 모두에서 0 표시에 모일 것입니다. 내부 플롯을 두 번 클릭하여 단일 세포 살아있는 림프구만 포함하는 새 플롯을 만듭니다. 칼슘 유입을 시각화하기 위해 x축에서 y축을 1 대 시간으로 변경합니다.

다음으로, 예열된 생물학적 샘플을 기계의 SIT에 넣습니다. 중간 유속에서 초당 2,500 - 3,000 이벤트로 샘플을 실행하여 제한된 수의 세포 집단에서 칼슘 유입을 시각화합니다. 비드 욕조에 다음 튜브를 추가합니다.

획득 제어에서 기록을 눌러 초기 데이터를 30초 동안 기록하여 샘플에서 칼슘 신호의 기초 수준을 얻습니다. 그런 다음 중지를 클릭하고 샘플 주입 포트에서 튜브를 제거합니다. 30마이크로그램의 비결합 항-CD3를 샘플 튜브에 직접 첨가하여 칼슘 유입을 시작합니다.

튜브를 샘플 주입 포트에 빠르게 다시 놓고 소프트웨어에서 기록을 누릅니다. 소프트웨어의 수집 컨트롤에서 경과된 시간을 관찰하면서 7분 동안 데이터를 기록합니다. 그런 다음 소프트웨어에서 중지를 누릅니다.