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인간 장내 박테리아의 현탁액이 들어 있는 튜브를 가져 가십시오.
인간 노로바이러스 바이러스 유사 입자 또는 VLP를 추가합니다. VLP에는 온전한 바이러스 캡시드가 포함되어 있지만 게놈 RNA가 부족하여 인간에게 전염성이 없습니다.
배양하는 동안 VLP 캡시드 단백질은 박테리아 표면에 발현되는 특정 탄수화물에 결합하여 VLP-박테리아 복합체를 형성합니다.
원심분리하여 복합체를 펠릿화하고 결합되지 않은 VLP를 폐기합니다.
단백질 함유 차단 용액을 도입하여 비특이적 항체 결합 부위를 차단하여 후속 단계에서 배경 염색을 줄입니다.
형광 표지된 VLP 특이적 항체를 첨가하고 배양합니다.
항체는 VLP 캡시드의 표적 부위에 결합하여 VLP-박테리아 복합체를 표지합니다.
복합체를 펠릿화하기 위해 원심분리기. 결합되지 않은 항체를 폐기하고 펠릿을 유세포 분석 완충액에 재현탁합니다.
유세포 분석기를 사용하여 VLP-박테리아 복합체에서 방출되는 형광 신호를 검출하여 샘플에서 결합된 박테리아의 비율을 정량화할
수 있습니다.원고에 설명된 대로 시약, 항체 및 박테리아를 준비한 후 BSL II 생물 안전 캐비닛에 모든 재료를 조립합니다.
인간 노로바이러스에 대한 바이러스 유사 입자는 BSL II 병원체로 나열되며 VLP를 사용하여 수행되는 모든 작업은 인증된 생물안전 캐비닛에서 수행되어야 합니다.
박테리아의 각 튜브에 10마이크로그램의 인간 노로바이러스 VLP를 첨가하고 피펫팅으로 완전히 혼합합니다. 튜브를 섭씨 37도에서 일정한 회전으로 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 튜브를 10,000배 g에서 5분 동안 원심분리합니다.
상청액을 흡인 및 버리고 박테리아 펠릿을 PBS 1밀리리터에 재현탁합니다. 세척 단계를 한 번 반복한 후 튜브를 10,000배 g으로 5분 동안 다시 원심분리합니다. 상청액을 버리고 VLP 박테리아 펠릿을 150마이크로리터의 5% 차단 완충액에 재현탁합니다.
발생하는 일반적인 오류는 튜브가 교체되고 잘못된 치료법이 추가되는 것입니다. 이를 방지하기 위해 모든 튜브를 올바른 치료에 해당하는 라인으로 배열하고 튜브에 한 번에 하나의 치료를 추가하십시오.
각 박테리아 샘플에 대해 희석된 인간 노로바이러스 G2 항체 50마이크로리터를 준비합니다. 5% 차단 완충액을 사용하여 대장균 사례 샘플에 대해 항체 1에서 125로 희석합니다. 동일한 희석 비율을 사용하여 각 박테리아 샘플에 대해 50마이크로리터의 희석된 이소형 항체를 준비합니다. 각 부착 분석 샘플을 깨끗한 1.5밀리리터 원심분리기 튜브로 옮겨 350마이크로리터 분취량으로 나눕니다.
염색되지 않은 대조군을 만들려면 각 박테리아 샘플의 첫 번째 분취량에 50마이크로리터의 차단 완충액을 추가합니다. 염색된 샘플의 경우, G2 항체 희석액 50마이크로리터를 두 번째 분취량 세트에 추가합니다. 희석된 이소형 항체 50마이크로리터를 세 번째 분취량 세트에 추가하여 이소타입 대조군을 생성합니다.
모든 샘플을 얼음 위와 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 모든 샘플을 10,000배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 각 샘플을 150마이크로리터의 FCSB에 재현탁합니다. 다시 말하지만, 모든 샘플을 10,000배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 다시 상청액을 버리고 샘플을 100마이크로리터의 FCSB에 재현탁합니다.
샘플을 마지막으로 한 번 원심분리하고 상청액을 버린 후 샘플을 150마이크로리터의 FCSB에 재현탁합니다. 각 샘플을 총 부피 550마이크로리터에 대해 400마이크로리터의 FCSB가 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 유세포 분석으로 분석할 때까지 샘플을 섭씨 4도에서 보관합니다.