형질전환 선충에서 Mitophagy를 검출하기 위한 In Vivo 분석

외부 미토콘드리아 막 단백질인 녹색 형광단 태그 DCT-1과 식세포체 막 단백질인 적색 형광단 태그 LGG-1을 발현하는 체벽 근육 세포가 있는 형질전환 선충류를 살펴보겠습니다.

미토파지 유도 약물이 들어 있는 성장 배지 위에 벌레를 놓습니다.

이 약물은 세포 미토콘드리아를 손상시켜 미토파지를 시작하거나 손상된 미토콘드리아의 선택적 제거를 시작합니다.

손상된 미토콘드리아의 DCT-1은 유비퀴틴화 및 인산화를 거쳐 식세포막에서 LGG-1과의 상호 작용을 촉진합니다.

식식단은 미토콘드리아 주위로 확장되어 리소좀 분해를 표적으로 하는 자가포식체를 형성합니다.

선충류를 현미경 슬라이드의 마취제에 넣어 고정시키고 커버슬립을 놓습니다.

형광 현미경으로 근육 세포 내의 노란색 반점을 시각화하여 녹색 형광을 방출하는 DCT-1과 적색 형광을 나타내는 LGG-1의 공동 국소화를 나타냅니다. 이것은 미토파지의 발생을 확인합니다.

첫째 날, 체벽 근육 세포에서 DCT-1::GFP 및 DsRed::LGG-1을 모두 발현하는 형질전환 동물의 L4 유충을 선택하고 OP50 시드 선충 성장 배지 플레이트에 배치합니다. 최소 3개의 플레이트를 사용하여 각 3.5센티미터 플레이트에 5-10마리의 벌레를 놓습니다. 완료되면 선충류를 섭씨 20도에서 배양합니다.

다음으로, 5일째에 15-20마리의 L4 형질전환 유충을 선택하고 신선한 OP50 시드 플레이트로 옮겨 선충류를 동기화합니다. 각 실험 조건에 대해 최소 5개의 플레이트를 사용하십시오. 7일째에 관심 있는 미토파지에 영향을 미치는 약물을 위한 비히클 플레이트 중 일부와 양성 대조군으로 사용할 비히클 플레이트 중 일부를 준비합니다.

다음으로, 대장균 파종 플레이트를 제곱센티미터당 222마이크로와트의 강도로 15분 동안 자외선에 노출시켜 플레이트의 미토파지 유도 화합물이 박테리아에 의해 대사되지 않도록 합니다. 이제 10마이크로리터의 관심 화합물을 시드 플레이트의 상단에 추가하고 동등한 양의 화합물 비히클을 비히클 플레이트에 음성 대조군으로 추가합니다.

미토파지 유도의 긍정적인 조절을 위해 미토콘드리아 독성 물질인 파라콰트를 첨가하십시오. 용액이 전체 표면을 절단할 때까지 플레이트를 부드럽게 휘젓고 뚜껑을 닫은 상태에서 플레이트를 실온에서 최소 1시간 동안 건조시킵니다. 건조되면 10-20마리의 2일 된 성인 형질전환 동물을 플레이트로 옮깁니다. 섭씨 20도에서 이틀 동안 배양합니다.

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