단백질 바이오마커 검출을 위한 모세관 전기영동 면역분석

질병 관련 단백질 바이오마커를 검출하려면 면역분석 플레이트를 가져 가십시오.

플레이트에는 크기 기반 단백질 분리에 필요한 사전 채워진 분리 및 스태킹 매트릭스가 포함되어 있습니다.

단백질과 면역분석 시약을 별도의 플레이트 웰에 로드합니다.

CEI 분석기 내에서 실행을 시작합니다. 분석기의 모세관 카트리지는 매트릭스를 흡인하여 각 모세관 내에 겔을 형성합니다.

그런 다음 모세혈관은 단백질을 흡인합니다. 전기영동 중에 단백질은 분자량에 따라 이동하고 분리됩니다.

분석기는 UV 광선을 도입하여 모세혈관의 단백질을 고정시킵니다.

세척 완충액은 매트릭스와 결합되지 않은 단백질을 제거합니다. 그런 다음 차단 버퍼가 유입되어 비특이적 상호 작용 부위를 차단합니다.

분석기는 바이오마커에 결합하는 1차 항체를 도입한 후 1차 항체와 상호 작용하는 과산화효소 접합 2차 항체를 도입합니다.

세척한 다음 화학발광 기질을 첨가합니다. 퍼옥시다아제는 기질을 산화시켜 발광을 방출합니다.

발광 강도를 측정하고 바이오마커 검출을 위한 단백질 표준과 비교합니다.

ALS 환자와 건강한 피험자로부터 100마이크로리터의 인간 혈소판 용해물을 수집한 후 모세관 레이아웃 및 샘플 준비를 위해 사내에서 생성된 템플릿을 작성합니다. 샘플 혼합물 준비 테이블은 동적이며 소스에서 제거해야 하는 부피의 양을 자동으로 계산합니다. 실온에 있어야 하는 표준 팩을 제외한 모든 분석 시약을 얼음 위에 놓습니다.

형광 마스터 믹스를 준비하려면 DTT의 투명한 튜브에 40마이크로리터의 탈이온수를 추가하고, 20마이크로리터의 10X 샘플 완충액과 20마이크로리터의 준비된 400밀리몰 DTT 용액을 분석 키트의 분홍색 튜브에 추가합니다.

비오티닐화된 사다리를 준비하려면 탈이온수 16마이크로리터, 10X 샘플 완충액 2마이크로리터, 준비된 400밀리몰 DTT 용액 2마이크로리터를 키트에 제공된 흰색 튜브에 추가합니다. 부드럽게 혼합한 후 변성하기 전에 사다리 용액을 200마이크로리터 PCR 튜브로 옮깁니다.

1.5마이크로리터의 10X 샘플 완충액과 148.5마이크로리터의 탈이온수를 600마이크로리터 미세 원심분리기 튜브에 추가합니다. 튜브를 얼음 위에 놓기 전에 소용돌이하여 혼합합니다. 표에 표시된 대로 관심 항체를 희석제에 직접 첨가하고 피펫 팁을 여러 번 세척하여 균질한 항체 용액을 얻습니다.

모세관 샘플 혼합물을 준비하려면 모든 PCR 튜브를 열고 표에 표시된 대로 형광 5X 샘플 완충액 1.6마이크로리터 분취량을 역피펫팅 기술을 사용하여 각 튜브에 추가하고 완충액이 추가될 때 각 튜브를 즉시 닫습니다. 모든 완충액이 추가되면 모든 튜브를 열고 표에 표시된 대로 0.1x 샘플 완충액을 부피로 추가하고 완충액이 추가되면 즉시 각 튜브를 닫습니다.

그런 다음 모든 튜브를 열고 표에 표시된 대로 단백질 샘플을 추가한 다음 즉시 각 튜브 캡을 닫습니다. 모든 샘플이 추가되면 벤치탑 원심분리기에서 모든 튜브를 잠시 원심분리합니다. Vortex를 사용하여 혼합하고 샘플을 다시 원심분리합니다.

두 번째 원심분리가 끝나면 모든 튜브를 가열된 뚜껑이 있는 열순환기에 넣고 표시된 조건에서 샘플을 변성시킵니다. 변성이 끝나면 샘플을 원심분리, 혼합 및 원심분리하고 다시 원심분리하고 모든 튜브를 얼음 위의 튜브 랙에 놓습니다.

도면을 가이드로 사용하여, 웰 D1에 10 마이크로리터의 스트렙타비딘 양 고추 냉이 과산화효소를 첨가하고, 10 마이크로리터의 적절한 2차 항체를 웰 D2 내지 D5에 첨가하고, 10 마이크로리터의 항체 희석제를 행 B의 각 웰 및 웰 C1에 첨가하고, 웰 C2 내지 C25에 대한 적절한 1차 항체 10마이크로리터, PCR 튜브 번호 1에서 웰 A1에 대한 비오티닐화 사다리 5 마이크로리터, 3마이크로리터의 샘플을 행 A2에서 A25까지, 15마이크로리터의 새로 준비된 루미놀 퍼옥사이드를 행 E의 각 웰에 넣습니다.

샘플 혼합물과 시약을 올바른 순서로 작은 웰에 피펫팅하는 것은 실험의 성공에 매우 중요하므로 매우 신중하게 수행해야 합니다.

그런 다음 500마이크로리터의 세척 완충액을 각 지정된 세척 완충액 웰에 첨가하고 원심분리에 의해 플레이트 내용물을 회전시킵니다.