동일 숙주 종의 1차 항체를 이용한 멀티플렉스 면역염색 방법

피질과 수질로 구성된 고정되고 투과된 부신 절편을 취하십시오. 끓는 산성 완충액으로 처리하여 항원 마스킹 해제를 위해 고정 유도 가교를 끊습니다.

비특이적 결합 부위를 차단하고 피질 특이적 마커에 결합하는 1차 항체를 도입합니다.

1차 항체를 표적으로 하는 비오티닐화 2차 항체 및 비오틴에 결합하는 스트렙타비딘 접합 과산화효소를 추가합니다.

형광단 태그가 지정된 티라미드와 과산화수소를 도입합니다.

고정화된 과산화효소는 과산화수소를 활용하여 근처 단백질에 결합하여 피질을 표지하는 티라마이드를 활성화합니다.

다음으로, 절편을 끓는 완충액으로 처리하여 결합된 항체를 제거합니다.

수질 특이적 마커와 비오티닐화된 2차 항체를 표적으로 하는 동일한 숙주 종 생성 1차 항체를 도입합니다.

스트렙타비딘 접합 과산화효소와 다른 형광단 접합 티라미드를 도입하여 수질을 표지합니다.

피질 특이적 1차 항체를 벗겨내면 재도입된 2차 항체가 결합하는 것을 억제하여 교차 반응성을 방지합니다.

핵 염색을 적용하고 이미징을 수행하여 뚜렷하게 염색된 피질과 수질을 시각화하여 항체 교차 반응성이 없음을 확인합니다.

염색하기 전에 포르말린 고정, 파라핀 포매 슬라이드를 표시된 대로 각 용액에 5분 동안 담그고 왁스를 제거하고 재수화합니다. 두 번째 증류수를 담근 후 뚜껑이 있는 피펫 팁 상자 바닥에 있는 끓는 구연산나트륨 용액 275밀리리터에 슬라이드를 넣고 상자를 70% 전력의 700와트 전자레인지에 8분 동안 넣습니다.

처리가 끝나면 뚜껑을 열고 용액을 실온으로 식힌 후 Coplin 병에 신선한 PBST를 5분 동안 세 번 세척하여 슬라이드를 세척합니다. 비특이적 결합 부위를 차단하려면 마지막 세척 후 각 슬라이드에서 초과 PBST를 흔들고 충분한 양의 적절한 차단 용액으로 슬라이드를 덮습니다.

습 챔버에서 실온에서 30분 후, 각 슬라이드에서 초과 차단 용액을 흔들고 각 샘플에 관심 있는 첫 번째 1차 항체 250마이크로리터를 추가합니다. 샘플이 마르는 것을 방지하기 위해 슬라이드를 파라핀 필름 조각으로 덮을 수 있습니다.

습 챔버에서 섭씨 4도에서 하룻밤 배양한 후, 슬라이드를 신선한 PBST로 세척당 5분 동안 세 번 세척합니다. 여분의 PBST를 털어낸 다음 실온에서 가습 챔버에서 1시간 동안 배양하기 위해 250마이크로리터의 적절한 2차 항체 용액으로 각 슬라이드를 빠르게 덮습니다.

배양이 끝나면 시연된 대로 슬라이드를 신선한 PBST에서 세 번 세척하고 각 슬라이드에 250마이크로리터의 새로 준비된 스트렙타비딘 양 고추냉이 과산화효소를 첨가합니다. 실온에서 30분 후, 슬라이드를 신선한 PBST로 세 번 세척한 다음 과도한 PBST를 털어내고 각 슬라이드를 새로 준비된 형광단 티라미드 용액 250마이크로리터로 덮습니다.

1분 후 슬라이드를 신선한 PBST에 담근 다음 신선한 PBST에 2분 동안 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후, PBS 용액에 1:1 글리세롤 몇 방울을 절편에 바르고 형광 현미경으로 형광 신호의 존재를 확인합니다.

첫 번째 항체 복합체를 벗겨내려면 항체 표지 슬라이드를 275밀리리터의 끓는 구연산나트륨 용액에 최소 8분 동안 넣습니다. 처리가 끝나면 뚜껑을 열고 용액을 실온으로 식힌 후 슬라이드를 PBST로 3회 세척할 때마다 5분 동안 세척합니다.

관심 있는 두 번째 표적 단백질을 염색하기 위해, 비특이적 결합에 대한 차단이 입증된 후, 밤새 섭씨 4도에서 250마이크로리터의 관심 있는 두 번째 1차 항체로 각 샘플을 표지합니다. 다음날 아침, 실온에서 1시간 동안 배양하기 위해 각 슬라이드를 250마이크로리터의 적절한 2차 항체 용액으로 덮기 전에 세척할 때마다 슬라이드를 5분 동안 3회 세척합니다.

배양이 끝나면 시연된 대로 슬라이드를 신선한 PBST에서 세 번 세척하고 각 슬라이드에 250마이크로리터의 새로 준비된 스트렙타비딘 양 고추냉이 과산화효소를 첨가합니다. 세 번의 PBST 세척 후 관심 있는 두 번째 표적 단백질에 대한 신호를 개발하려면 슬라이드를 다른 형광 스펙트럼의 형광단 접합 티라미드로 처리합니다.

티라마이드 신호 발생을 멈추려면 슬라이드를 PBST에 담근 다음 적절한 핵 염료로 샘플을 염색합니다.