면역요법 내성 T 세포 하위 집단을 분석하기 위한 다중방향 면역형광 이미징

종양 미세 환경에서 CD8+ T 세포가 침윤하는 것을 나타내는 신장 세포 암종 조직 냉동 절편을 취하십시오.

아세톤으로 처리하여 조직을 고정하고 투과시킵니다. 과도한 아세톤을 제거하기 위해 씻으십시오.

내인성 조직 비오틴을 포화시키기 위해 아비딘을 첨가합니다. 다음으로, 비오틴을 첨가하여 고정된 아비딘 결합 부위를 차단하여 비특이적 상호 작용을 최소화합니다.

면역글로불린이 함유된 혈청을 도포하여 면역세포 Fc 수용체를 차단하여 비특이적 항체 결합을 방지합니다.

세포독성 T 세포 마커인 CD8과 면역요법에 내성이 있는 CD8+ T 세포 하위 집단에 의해 발현되는 억제 수용체인 PD-1 및 Tim-3을 표적으로 하는 1차 항체 칵테일을 추가합니다.

항-CD8 및 항-Tim-3 항체를 표적으로 하는 뚜렷한 형광단 표지 2차 항체를 도입합니다.

항-PD-1 항체를 표적으로 하는 비오티닐화된 2차 항체와 비오틴에 결합하는 다른 형광단 표지 스트렙타비딘을 추가합니다.

염료 함유 마운팅 배지를 세포 핵을 염색하기 위해 도포하고 커버슬립을 놓습니다.

다중 스펙트럼 형광 이미지를 획득하여 종양 침윤 CD8+ T 세포와 PD-1, Tim-3 또는 둘 다를 발현하는 면역요법 내성 하위 집단을 식별합니다.

해동 후 종이 타월을 사용하여 조직 절편 주변의 슬라이드를 조심스럽게 말리고 소수성 배리어 펜으로 조직을 감쌉니다. 장벽이 건조되면 샘플을 100% 아세톤에 5분 동안 고정한 다음 2분 동안 자연 건조합니다. 그런 다음 슬라이드를 TBS에서 10분 동안 세척합니다.

0.1% 아비딘 3방울로 어둠 속에서 10분 동안 슬라이드를 전처리합니다. 그런 다음 슬라이드를 탭하거나 튕겨 아비딘 용액으로 조직을 덮습니다. 각 샘플에 0.01% 비오틴 3방울을 추가하고 샘플 전체에 비오틴을 두드리거나 튕긴 다음 방금 시연한 대로 TBS 세척을 수행합니다. 그런 다음 실온에서 30분 동안 TBS에 5% 정상 혈청 100마이크로리터로 비특이적 결합을 차단합니다.

배양이 끝나면 슬라이드를 두드려 여분의 혈청을 제거하고 슬라이드를 100마이크로리터의 관심 1차 항체 칵테일에서 가습 챔버에서 1시간 동안 배양합니다. 항체 표지 슬라이드를 TBST에서 5분 동안 세척합니다.

건조 후, 가습 챔버에서 30분 동안 100마이크로리터의 관심 2차 항체 칵테일로 세포를 표지한 후 TBS에서 10분 동안 세척합니다. 건조된 2차 항체 표지 슬라이드를 100마이크로리터의 관심 3차 항체 칵테일과 함께 30분 동안 배양한 후 최종 10분 TBS 세척합니다.

세척이 끝나면 슬라이드를 건조시키고 DAPI가 보충된 마운팅 매체로 티슈를 장착합니다. 그런 다음 각 슬라이드를 커버 슬립으로 덮고 마운팅 매체를 최소 2시간 동안 굳힙니다.

슬라이드를 스캔하려면 현미경 소프트웨어를 열고 이미지 스캔 프로토콜을 로드하십시오. 첫 번째 슬라이드를 현미경 스테이지에 로드합니다. 그런 다음 컨트롤 바에서 노출 설정을 클릭하고 충분하지만 포화되지 않은 신호가 얻을 때까지 각 필터의 노출 시간을 조정합니다.

위쪽 패널에서 시작을 클릭하고 랩 ID 폴더를 엽니다. 첫 번째 슬라이드의 ID를 입력하고 다음을 클릭합니다.

4배 배율의 밝은 시야광 아래에서 슬라이드의 개요를 얻으려면 흑백 이미징 및 표본 찾기를 클릭합니다. 스캔할 조직 영역을 선택하려면 Control 키를 누르고 커서를 사용하여 4배율로 스캔할 관심 영역을 선택하거나 선택 취소합니다.

각 영역의 형광 적색-청색-녹색 이미지를 얻으려면 저전력 이미징을 클릭합니다. 고배율 필드 선택의 경우 Control 키를 누르고 20배 배율로 스캔할 조직 영역에 해당하는 5개 이상의 관심 영역을 선택합니다.

그런 다음 각 필드의 다중 스펙트럼 이미지 획득을 얻으려면 고출력 이미징을 클릭하고 데이터 스토리지를 클릭하여 이미지를 적절한 실험실 ID 폴더에 저장합니다.