감염된 세포의 바이러스 단백질 국소화를 위한 면역형광 기술

부착된 숙주 세포가 포함된 슬라이드로 시작합니다.

바이러스를 추가하고 숙주 세포에 들어가도록 합니다.

사용한 배지를 제거합니다. 바이러스 단백질 합성 및 수송을 가능하게 하기 위해 신선한 배지를 추가합니다.

파라포름알데히드를 사용하여 세포 형태와 단백질 위치를 보존합니다.

세제 분자를 첨가하여 세포를 투과성 있게 만듭니다.

차단 버퍼를 적용하여 비표적 결합 부위를 차단합니다.

표적 바이러스 단백질에 결합하는 1차 항체를 추가합니다. 결합되지 않은 항체를 제거합니다.

바이러스 단백질을 형광으로 태깅하기 위한 적색 형광단 접합 2차 항체와 오버레이합니다. 결합되지 않은 항체를 제거합니다.

형광 핵 염료 함유 마운팅 매체를 첨가하여 핵을 염색합니다.

공초점 현미경을 사용하여 적색 형광 바이러스 단백질과 청색 형광 숙주 핵의 위치를 관찰합니다.

파란색 영역 주변의 더 강한 빨간색 신호는 세포질 국소화를 나타내고 내부의 더 강한 신호는 핵 국소화를 나타냅니다.

파란색 영역 안팎의 동일한 신호 수준은 단백질이 핵과 세포질 모두에 위치한다는 것을 나타냅니다.

바이러스 감염 20 내지 24시간 전에, 5% 이산화탄소와 함께 섭씨 37도에서 하룻밤 배양하기 위해 성장 배지에서 4웰 11mm 엇갈린 슬라이드에 웰당 5 x 10 4 인간 배아 폐 또는 HEL 섬유아세포 세포를 시드합니다.

배양 배지가 쏟아지지 않도록 주의하면서 세포가 고르게 분포되도록 슬라이드를 철저히 흔드는 것이 중요합니다. 다음날, 70% 내지 80% 합류 배양의 상청액을 세포당 4-10개의 플라크 형성 단위를 함유하는 Medium-199로 교체하고, 슬라이드를 섭씨 37도에서 1시간 동안 흔들면서 놓는다.

배양이 끝나면 상청액을 신선한 성장 배지로 교체하고 적절한 실험 감염 기간 동안 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 바이러스에 감염된 세포의 면역형광 염색을 위해 PBS로 세포를 3회 빠르게 세척한 후 웰당 PBS에 4% 파라포름알데히드 200마이크로리터에서 8-10분 동안 배양합니다. 고정이 끝나면 세척당 200마이크로리터의 PBS로 세포를 3회 세척하고 웰당 100마이크로리터의 0.2% 비이온성 계면활성제로 세포를 5-10분 동안 투과화합니다.

시연된 대로 투과화된 세포를 PBS에서 3회 세척하고 실온에서 1시간 동안 배양하기 위해 각 웰에 200마이크로리터의 차단 완충액을 첨가합니다. 다음으로, 2시간 실온 배양을 위해 각 웰에 적절한 농도의 관심 1차 항체를 추가합니다.

배양이 끝나면 신선한 차단 완충액에서 10분 동안 세 번 세척하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거하고 빛으로부터 보호된 실온에서 1시간 동안 배양하기 위해 각 웰에 적절한 2차 항체를 추가합니다.

배양이 끝나면, 시연된 대로 세포를 차단 완충액에서 세 번 세척한 다음 PBS에서 한 번 세척한 다음 각 웰에 DAPI를 보충한 퇴색 방지 마운팅 배지 1방울을 추가합니다. 그런 다음 슬라이드 위에 커버슬립을 놓고 투명한 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다.

커버슬립을 장착하는 동안 부드러운 압력을 가하면 과도한 장착 매체가 제거되어 고품질 이미지를 획득하는 데 도움이 됩니다.

ICP0의 핵 및 세포질 분포를 분석하려면 공초점 응용 소프트웨어에서 프로젝트를 열고 이미지를 선택합니다. 수량 탭을 열고 도구 메뉴에서 관심 영역 정렬을 선택합니다. 선 그리기를 선택하고 분석할 셀을 가로질러 세로선을 그립니다. 관심 단백질과 DAPI 모두에 대한 선을 따라 형광 강도를 보여주는 히스토그램이 나타납니다.

배경 염색을 기반으로 각 실험에서 단백질의 세포 내 분포를 분석하기 위해 관심 단백질의 강도에 대한 일정한 임계값을 설정합니다. 평균적으로 단백질 신호가 핵 영역의 임계값보다 낮지만 DAPI 경계를 넘어 임계값보다 높은 경우 단백질 신호를 주로 세포질 내에 위치한 것으로 분류합니다.

단백질 신호가 핵 전체의 임계값을 초과하고 DAPI 신호의 경계를 넘어서는 경우 단백질 신호를 핵과 세포질 국소화로 그룹화합니다. 단백질 신호가 핵의 임계값을 초과하지만 평균적으로 DAPI 신호의 경계 외부의 임계값보다 낮은 경우 단백질 신호를 핵 국소화로 그룹화합니다.