쥐의 폐에 서식하는 선천적 및 적응적 면역 세포를 식별하는 In vitro 방법
0 조회수 • 5:54 분 • July 8th, 2025
진 쥐 폐 조직을 소화 완충액에 넣고 생리학적 온도에서 배양합니다.
완충 효소는 조직 기질을 분해하여 세포를 느슨하게 합니다.
분쇄하여 세포 덩어리를 해리시키고 스트레이너를 사용하여 현탁액을 여과하여 단일 세포를 분리합니다.
원심분리하여 조직 파편이 있는 상층액을 제거합니다. 적혈구를 용해하기 위해 용해 완충액과 함께 세포를 배양합니다.
원심분리하여 세포 파편 함유 상청액을 버립니다. 세포를 재현탁하고 마이크로플레이트로 옮깁니다.
항체를 추가하여 Fc 수용체를 차단하여 백그라운드 염색을 방지합니다.
선천성 면역 세포(단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포, 호중구, 호산구 및 적응 면역 세포인 B 및 T 림프구)의 특정 표면 마커를 표적으로 하는 형광단 표지 항체 칵테일을 도입합니다.
세포를 고정하고 투과시킵니다. 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 및 호산구의 세포내 마커에 특이적인 형광단 표지 항체를 추가합니다.
유세포 분석을 사용하여 표지된 면역 세포를 분류합니다.
폐를 페트리 접시로 옮깁니다. 두 개의 가는 메스를 사용하여 다진 다음 50밀리리터 원뿔형 튜브에 넣습니다. 5밀리리터의 분해 완충액을 첨가하여 플레이트를 세척합니다. 튜브의 뚜껑을 단단히 닫고 섭씨 37도에서 분당 150회전의 속도로 궤도 셰이커에서 30분 동안 폐를 소화합니다. 10밀리리터의 차가운 BSA 완충액을 첨가하여 반응을 중지합니다.
소화 후 18게이지 바늘을 사용하여 폐 조각을 섞고 녹입니다. 새로운 50밀리리터 원뿔형 튜브 위에 70마이크로미터 필터 스트레이너를 놓고 소화된 폐 혼합물을 스트레이너로 옮깁니다.
10밀리리터 주사기 플런저의 고무 면을 사용하여 필터에 남아 있는 폐 조각을 부수고 BSA 완충액으로 세척합니다. 단일 세포 현탁액을 섭씨 7도에서 8분 동안 350g에서 원심분리합니다. 상청액을 버리고 세포를 1밀리리터의 ACK 용해 완충액에 재현탁합니다. 1밀리리터 피펫을 사용하여 현탁액을 혼합하고 실온에서 90초 동안 배양합니다.
반응 혼합물에 10 밀리리터의 차가운 BSA 완충액을 첨가하고 섭씨 4도에서 7분 동안 350g으로 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오. 펠릿을 염색 완충액에 재현탁하고 혈구계를 사용하여 세포를 계산합니다. 표면 염색을 위해 밀리리터당 500만 세포의 농도로 세포를 재현
탁합니다.웰당 200마이크로리터의 100만 개의 세포를 96웰 플레이트로 옮기고 플레이트를 섭씨 4도에서 7분 동안 350g으로 원심분리합니다. 염색 완충액에 항-16/32 항체를 희석하여 유세포 분석 블록 용액을 준비합니다.
세포를 50마이크로리터의 유세포 분석 블록 용액에 재현탁합니다. 현탁액을 섭씨 4도에서 또는 얼음 위에서 15-20분 동안 배양합니다. 그런 다음 150마이크로리터의 염색 완충액을 플레이트에 첨가하고 섭씨 4도에서 5분 동안 350g으로 원심 분리합니다.
염색 완충액에서 표면 항체를 희석하여 표면 항체 용액을 준비합니다. 세포를 50마이크로리터의 표면 항체 용액에 재현탁하고 어둠 속에서 감씨 4도에서 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 염색 완충액으로 세포를 두 번 세척합니다.
고정및 투과화 희석제 3부와 염색 완충액 1부를 혼합하여 고정 및 투과화 완충액을 준비합니다. 96웰 플레이트의 웰당 미리 준비된 완충액 50마이크로리터에 세포를 재현탁하고 어둠 속에서 섭씨 4도에서 20-25분 동안 배양합니다.
투과화 완충액을 정제된 탈이온수로 희석하여 1배 투과화 완충액을 제조하고 이를 사용하여 세포를 세척합니다. 투과화 완충액 1밀리리터로 희석하여 세포내 항체 용액을 준비합니다. 96웰 플레이트의 웰당 희석된 세포내 항체 용액 50마이크로리터에 세포를 재현탁하고 어둠 속에서 섭씨 4도에서 40분 동안 배양합니다.
투과화 완충액으로 세포를 세척한 다음 염색 완충액으로 세척합니다. 최종 세척 후, 세포를 200마이크로리터의 염색 완충액에 재현탁합니다. 유세포 분석기에서 샘플당 최소 150만 개의 세포를 획득합니다.
개요
본 논문은 유세포 분석법을 이용하여 마우스 폐 조직에서 면역 세포를 분리하고 분석하는 프로토콜을 상세히 다룹니다. 이 방법은 조직 소화, 세포 용해 및 특정 항체를 이용한 염색 과정을 통해 다양한 면역 세포 유형을 식별하는 과정을 포함합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 면역학
- 세포 생물학
- 유세포 분석법
배경
- 면역 세포군을 이해하는 것은 폐 질환 연구에 있어 매우 중요합니다.
- 유세포 분석법을 통해 세포 표면 및 세포 내 마커에 대한 상세한 분석이 가능합니다.
- 인간 질병 연구에는 일반적으로 생쥐 모델이 사용됩니다.
- 조직으로부터 단일 세포를 분리하는 것은 면역학 연구의 핵심 단계입니다.
연구 목적
- 폐 조직에서 면역 세포를 분리하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발합니다.
- 유세포 분석법(flow cytometry)을 이용한 면역 세포군 분석을 용이하게 합니다.
- 폐 병리학의 면역 반응에 대한 이해를 높입니다.
사용된 방법
- 다진 폐 조직을 완충액에서 소화시켜 단일 세포를 분리합니다.
- 적혈구를 제거하기 위해 세포를 용해 버퍼로 처리합니다.
- 표면 및 세포 내 염색을 위해 형광체 표지 항체를 사용합니다.
- 유세포 분석법을 이용하여 표지된 면역 세포를 분류하고 분석합니다.
주요 결과
- 마우스 폐 조직으로부터 다양한 면역 세포 유형의 성공적인 분리.
- 유세포 분석을 통한 서로 다른 면역 세포군 간의 효과적인 구별.
- 본 프로토콜을 통한 면역 반응의 세밀한 특성 분석 가능.
- 분리된 세포의 높은 생존율로 후속 실험 적용 가능.
결론
- 설명된 방법은 폐 면역 세포를 분리하고 분석하는 데 효율적입니다.
- 이 접근 방식은 폐 면역학과 관련된 다양한 연구에 적용될 수 있습니다.
- 향후 연구에서는 이 프로토콜을 기반으로 질병의 면역 기전을 탐구할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
본 방법은 바이오 제약 R&D 팀이 마우스 폐의 선천성 및 적응성 면역 세포 군집을 정량적으로 분석할 수 있게 하여, 면역학 및 호흡기 질환 프로그램의 타겟 검증과 기전적 리스크 제거를 지원합니다. 재현 가능하고 유세포 분석에 즉시 사용할 수 있는 단일 세포 현탁액을 제공함으로써, 전임상 모델의 예측 신뢰도를 높이고 폐 면역을 조절하는 치료제 후보 물질의 진행 여부(go/no-go) 결정에 유용한 정보를 제공합니다. 본 프로토콜은 면역 표현형 분석을 발견 및 중개 연구 워크플로우 전반에서 확장 및 재사용 가능한 역량으로 구축합니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: 폐 조직 내 면역 세포 서브셋을 정량화하여 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 단핵구, 대식세포, 수지상세포, NK 세포, 중성구, 호산구, B 세포 및 T 세포의 표준화된 분리 및 표현형 분석을 통해 생물학적 리스크 감소를 지원합니다.
- 예측적 가치: 시험 화합물에 의한 경로 관여 및 면역 조절을 명확히 하는 정량적 유세포 분석 결과물을 생성합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 하위 항체 패널 최적화 및 형광체 적정에 적합하며 검증된 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
- 재현성: 표준화된 소화, 용해 및 염색 단계를 통해 실험 간 일관된 면역 세포 수율을 보장합니다.
- 확장성: 96-웰 플레이트 형식을 통해 스크리닝 캠페인을 위한 여러 조건 또는 시점의 병렬 처리가 가능합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질환 관련성: 마우스 폐 질환 모델에서 면역 프로파일링을 가능하게 하여 발견 단계부터 전임상 연구까지의 연속성을 유지합니다.
- 바이오마커 정렬: 면역 세포 빈도와 기능적 판독 값 또는 조직 병리학적 결과 간의 상관관계 분석을 용이하게 합니다.
- 리스크 조정 추진: 면역 프로파일링 데이터는 화합물 효과에 대한 기전적 해석과 포트폴리오 우선순위 결정(triage)을 뒷받침합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 타겟 검증부터 리드 화합물 발굴, 그리고 전임상 평가에 이르는 발견 연속체(discovery continuum)에 부합하며, 폐 조직 내 화합물 활성에 대한 면역학적 맥락을 제공합니다.
- 발견 생물학(Discovery Biology): 마우스 폐에 어떤 면역 세포군이 존재하고 반응하는지 식별함으로써 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝(Screening): 정량 가능한 표면 및 세포 내 마커가 포함된 분석 준비 완료 세포를 제공하여 신뢰할 수 있는 화합물 스크리닝을 가능하게 합니다.
- 분석(Analytics): 처리군 간의 면역 세포 빈도와 활성 상태에 대한 통계적 비교를 가능하게 합니다.
- 중개 연구(Translational Research): 표준화된 면역 표현형 분석을 통해 인비트로(in vitro) 결과와 전임상 연속성을 연결합니다.
- 기업적 재사용(Enterprise Reuse): 여러 폐 면역학 프로젝트에 적용 가능한 면역 세포 분리의 전이 가능한 프로토콜을 확립합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 폐 면역 반응의 기전적 모호성을 줄임으로써 타겟 검증의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 정의된 소화, 용해 및 항체 염색 프로토콜을 통해 재현성과 표준화를 보장합니다.
- 전략적 가치: 면역 매개 작용 기전 데이터를 제공하여 go/no-go 결정을 개선하고, 후기 단계의 생물학적 리스크를 줄입니다.
- 포트폴리오 영향: 질병 관련 시스템 내의 면역 조절 프로파일을 기반으로 후보 물질의 리스크 조정 우선순위 지정을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 조직 해리, 유세포 분석 및 다색 항체 패널 설계에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 다중 형광체 검출이 가능한 유세포 분석기 및 세포 처리를 위한 원심분리기 장비의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 사용자와 사이트 간의 항체 역가, 염색 완충액 및 게이팅 전략의 표준화가 필요합니다.
- 다른 조직이나 종에 적용하려면 소화 효소 및 용해 조건의 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 실질적인 제한 사항으로는 면역 세포 회수량의 조직별 가변성과 생존율 유지를 위한 신선한 조직 처리의 필요성이 있습니다.
바이오 제약 FAQ
콜라게나아제 E를 사용하여 뮤린 결장에서 라미나 프로프리아 단핵 세포의 분리
관련 동영상
0 조회수
절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석
관련 동영상
0 조회수
Anopheles 모기의 정자 형성을 연구하기 위한 전체 장착 형광 In Situ 교잡
관련 동영상
0 조회수
마우스 폐에 돌기 세포의 분리
관련 동영상
0 조회수
기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연
관련 동영상
0 조회수
유세포 분석에 의한 Bronchoalveolar Lavage Fluid에서 면역 세포의 식별 및 계수
관련 동영상
0 조회수
쥐 폐의 기관지 폐포 세척은 염증성 세포의 침윤을 분석하는
관련 동영상
0 조회수
고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징
관련 동영상
0 조회수
폐 환경에서 면역 세포 및 전염증성 중재자의 특성화
관련 동영상
0 조회수
뮤린 폐의 선천적 및 적응성 면역 세포의 확인을 위한 유세포 분석
관련 동영상
0 조회수
마지막 업데이트: 29 8월 2026