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면역학
0 조회수 • 4:50 분 • January 15th, 2026
호중구가 들어 있는 튜브로 시작하십시오. 단백질 분해를 방지하기 위해 프로테이나제 억제제를 함유한 완충액을 첨가합니다.
호중구막을 투과화하기 위해 적절한 세제를 첨가
하십시오.얼음 욕조에서 고주파 음파로 샘플을 초음파 처리하여 세포막을 파괴하여 다양한 단백질을 포함한 세포 내 내용물을 방출합니다.
잠시 원심분리하여 튜브 벽에서 내용물을 수집하고 적절한 튜브로 옮깁니다.
환원제를 도입하고 고온에서 배양하여 이황화 결합 절단을 촉진하여 단백질을 변성시킵니다.
식힌 후 설프히드릴 그룹을 알킬화하는 알킬화 시약을 도입합니다.
차가운 아세톤을 첨가하여 단백질 침전을 유도합니다.
원심분리하여 단백질과 세포 조각을 펠릿화합니다. 상청액을 제거하고 자연 건조시킵니다.
변성제 함유 완충액을 도입하고 초음파 처리하여 단백질 펠릿을 재용해합니다.
마지막으로 단백질을 절단하는 프로테아제 혼합물을 추가합니다. 추가 처리를 위해 샘플을 보관하십시오.
시작하려면 샘플을 400배 g에서 5분 동안 원심분리하여 호중구 분화된 HL60 세포를 15밀리리터 튜브에 수집합니다.
15밀리리터의 PBS를 첨가하여 세포 펠릿을 두 번 세척하고 400배 g에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.
프로테이나제 억제제 칵테일 정제를 함유한 얼음처럼 차가운 100밀리몰 Tris HCl pH 8.5 300마이크로리터를 각 샘플에 넣고 잠시 소용돌이치게 합니다.
그런 다음 20% SDS를 1 x 10 부피로 2% 최종 농도에 첨가하고 얼음 욕조에서 30초 동안 켜고 30초 동안 샘플을 프로브 초음파 처리하여 10% 전력으로 5 사이클 동안
처리합니다.튜브 벽에서 스프레이 오프를 수집하려면 세포 파편이 펠릿을 형성하지 않도록 최대 속도로 샘플을 5-10초 동안 원심분리합니다.
샘플을 15밀리리터 튜브에서 2밀리리터 튜브로 옮기고 1 x 100 부피의 1몰 스톡 디티오스레이톨을 10밀리몰의 최종 농도까지 첨가합니다.
잠시 소용돌이치는 후, 샘플을 섭씨 95도에서 10분 동안 배양하고 800rpm으로 흔듭니다. 그런 다음 샘플을 얼음 위에 올려 실온으로 식힙니다.
다음으로, 어두운 조건에서 1 x 10 부피의 0.55몰 요오도아세트아미드를 55밀리몰의 최종 농도로 첨가하고, 튜브를 소용돌이치게 한 후 어두운 곳에서 실온에서 20분 동안 배양합니다.
배양이 끝나면 100% 얼음처럼 차가운 아세톤을 최종 농도 80%까지 첨가합니다. 샘플을 섭씨 영하 20도에서 밤새 보관
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