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소형화된 정제 컬럼인 STop And Go Extraction 또는 STAGE Tip을 사용하십시오.
팁에는 소수성 상호 작용 기반 펩타이드 정제를 위해 긴 탄화수소 사슬에 결합된 작은 실리카 비드가 포함되어 있습니다.
높은비율의 아세토니트릴을 함유한 완충액으로 세척하여 수지 불순물을 제거합니다.
결합 완충액과 원심분리기를 도입하여 최적의 펩타이드 결합을 위해 컬럼을 평형화합니다.
펩타이드 단편과 염을 포함한 불순물을 포함하는 분화된 호중구 유사 세포에서 얻은 사전 소화된 펩타이드 샘플을 로드합니다.
원심분리기를 사용하여 샘플을 컬럼을 통과시킵니다. 펩타이드 단편은 소수성 상호 작용을 통해 탄화수소 사슬에 결합하는 반면 염은 제거됩니다.
결합 완충액을 첨가하고 원심분리하여 나머지 불순물을 제거합니다.
용출을 위해 고아세토니트릴 함유 완충액을 도입합니다.
주사기를 사용하여 버퍼를 컬럼에 통과시킵니다. 아세토니트릴은 탄화수소 사슬에 결합하여 완충액으로 용리되는 펩타이드 단편을 대체합니다.
프로테오믹스 프로파일링을 수행하여 정제된 펩타이드를 식별합니다.
시작하려면 200마이크로리터 피펫 팁에 C18 수지 3층을 포장하여 각 펩타이드 샘플에 대해 STop And Go 추출 또는 STAGE 팁을 구성합니다.
1 x 10 부피의 중단 용액을 첨가하여 이전에 배양된 펩타이드 샘플의 효소 분해를 중지합니다. 샘플을 13,200rpm에서 10분 동안 원심분리하고 상청액을 새 2밀리리터 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 100마이크로리터의 100% 아세토니트릴로 STAGE 팁을 세척하고 STAGE 팁을 1000g에서 2분 동안 또는 모든 액체가 C18 수 지를 통과할 때까지 원심분리합니다.
동일한 원심분리 조건으로 50마이크로리터의 완충액 B로 STAGE 팁 세척을 반복한 다음 200마이크로리터의 완충액 A
를 반복합니다.샘플을 STAGE 팁에 넣어 1000g에서 3-5분 동안 원심분리 합니다. 그런 다음 1000g에서 3-5분 동안 원심분리하여 200마이크로리터의 완충액 A로 STAGE 팁을 세척합니다.
그런 다음 각 STAGE 팁에 50마이크로리터의 버퍼 B를 추가하고 주사기를 사용하여 버퍼 B가 포함된 샘플을 0.2밀리리터 PCR 튜브에 용리합니다.
샘플이 용리되면 진공 원심분리기를 사용하여 펩타이드를 45분 동안 건조시킵니다. 텍스트 원고에 설명된 조건으로 고분해능 질량 분석법에서 샘플을 실행합니다.
단백질체 프로파일링을 위해 데이터를 처리하려면 질량 분석법에서 얻은 원시 데이터 파일을 MaxQuant 소프트웨어에 업로드합니다. 소프트웨어의 모든 매개변수와 조정에 대해서는 텍스트 원고를 참조하십시오.
전역 매개변수에서 유기체 ID, 단백질 수 및 파일 다운로드 날짜를 기록하는 Uniprot 데이터베이스에서 다운로드한 서열 식별을 위해 호모 사피엔스의 FASTA 파일을 가져옵니다.
처리할 컴퓨터 코어 수를 설정하고 시작을 선택합니다. MaxQuant가 완료되면 데이터 저장소에 업로드하는 데 필요한 다른 파일과 함께 '결합' 폴더가 생성됩니다.
데이터를 분석하려면 'proteingroups.txt'을 Perseus에 업로드하고 모든 라벨 없는 정량 또는 LFQ 강도 파일을 '메인' 창에 선택합니다. 오염 물질, 역방향 펩타이드 및 사이트로만 식별된 펩타이드를 제거하여 행을 필터링하고 로그2(x)로 데이터를 변환합니다.
각 반복실험에서 검출된 단백질의 수를 관찰하려면 숫자 벤 다이어그램을 구성하고 하나의 생물학적 샘플의 모든 반복실험에 대해 동일한 이름을 제공하여 각 샘플에 대한 범주형 주석을 설정합니다.
반복실험의 50% 이상과 적어도 하나의 그룹 내에서 확인된 단백질을 사용하여 유효한 값을 기준으로 행을 필터링합니다. LFQ의 결측값을 대체하려면 정규 분포에서 대치를 수행합니다.
페르세우스 웹사이트에서 다운로드한 주석 정보를 'bin', 'conf' 및 'annotation' 폴더에 txt.gz FASTA 파일을 추가하여 단백질 행에 추가합니다. 단백질 이름, 유전자 이름, 유전자 온톨로지와 같은 특정 용어를 가져옵니다.
이제 행렬이 완성되었으며 주성분 분석 플롯, 히트 맵 및 범주 보강과 같은 도구에서 시각화할 수 있습니다. 통계 테스트를 수행하여 테스트 조건 간의 단백질 풍부도의 유의미한 변화를 확인합니다.
