기능성 SARS-CoV-2 중화항체 평가

중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 또는 SARS-CoV-2에 대한 다양한 농도의 중화 항체를 함유한 연속적으로 희석된 인간 혈청으로 시작합니다.

SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 포함하는 지질 이중층 내에 캡슐화된 루시페라제 RNA, 인테그라제 및 역전사 효소가 있는 유사형 바이러스를 도입합니다.

항체는 혈청 희석을 기반으로 바이러스를 중화하며, 희석도가 낮을수록 최대 중화를 나타냅니다.

안지오텐신 전환 효소-2 수용체 또는 ACE2 수용체 및 막관통 프로테아제 세린-2 또는 TMPRSS2를 발현하는 표적 세포를 도입합니다.

더 높은 혈청 희석액에서 중화되지 않은 바이러스는 ACE2 수용체와 상호 작용하는 반면 TMPRSS2는 스파이크 단백질을 절단하여 바이러스 융합을 가능하게 합니다.

진입 시 루시페라아제 RNA는 숙주 게놈에 통합되어 루시페라아제 효소를 생성하는 DNA로 역전사됩니다.

배지를 루시페라제 기질과 용해제를 포함하는 분석 완충액으로 교체합니다.

세포는 용해되어 기질과 상호 작용하여 높은 발광을 생성하는 세포내 루시페라아제를 방출합니다.

혈청 희석액에 걸친 발광을 정량화하여 바이러스 중화 비율을 결정합니다 — 50% 중화를 달성한 희석액은 중화 역가를 나타냅니다.

시작하려면 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 50마이크로리터의 DMEM을 흰색 96웰 플레이트의 열 B에서 H, 열 1-12에 추가합니다.

5

마이크로리터의 회복기 혈청을 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 총 부피 100마이크로리터 DMEM으로 행 A, 열 2 내지 10의 웰에 추가합니다. 5마이크로리터의 양성 및 음성 항혈청제를 대조군으로 웰 A11 및 A12에 추가합니다.

행

A의 웰에서 50마이크로리터의 용액을 제거하고 그 아래에 있는 모든 웰을 2배 연속 희석합니다. 각 희석에 대해 다중 채널 피펫을 사용하여 기포를 생성하지 않고 위아래로 피펫팅하여 용액을 5-10회 혼합합니다.

연속 희석을 완료한 후 각 컬럼의 마지막 웰에서 마지막 50마이크로리터를 버립니다.

플레이트

를 분당 500회전으로 1분 동안 원심분리하여 웰 벽에 액체가 남지 않도록 합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 SARS-CoV-2 PV를 희석하는 데 필요한 DMEM의 양을 계산합니다.

희

석된 PV 용액을 피펫 대야에 혼합하고 세포 전용 대조군을 구성하는 웰 A6 내지 A12를 제외하고 각 웰에 50마이크로리터를 분취합