기능성 SARS-CoV-2 중화항체 평가

중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 또는 SARS-CoV-2에 대한 다양한 농도의 중화 항체를 함유한 연속적으로 희석된 인간 혈청으로 시작합니다.

SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 포함하는 지질 이중층 내에 캡슐화된 루시페라제 RNA, 인테그라제 및 역전사 효소가 있는 유사형 바이러스를 도입합니다.

항체는 혈청 희석을 기반으로 바이러스를 중화하며, 희석도가 낮을수록 최대 중화를 나타냅니다.

안지오텐신 전환 효소-2 수용체 또는 ACE2 수용체 및 막관통 프로테아제 세린-2 또는 TMPRSS2를 발현하는 표적 세포를 도입합니다.

더 높은 혈청 희석액에서 중화되지 않은 바이러스는 ACE2 수용체와 상호 작용하는 반면 TMPRSS2는 스파이크 단백질을 절단하여 바이러스 융합을 가능하게 합니다.

진입 시 루시페라아제 RNA는 숙주 게놈에 통합되어 루시페라아제 효소를 생성하는 DNA로 역전사됩니다.

배지를 루시페라제 기질과 용해제를 포함하는 분석 완충액으로 교체합니다.

세포는 용해되어 기질과 상호 작용하여 높은 발광을 생성하는 세포내 루시페라아제를 방출합니다.

혈청 희석액에 걸친 발광을 정량화하여 바이러스 중화 비율을 결정합니다 — 50% 중화를 달성한 희석액은 중화 역가를 나타냅니다.

시작하려면 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 50마이크로리터의 DMEM을 흰색 96웰 플레이트의 열 B에서 H, 열 1-12에 추가합니다.

마이크로리터의 회복기 혈청을 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 총 부피 100마이크로리터 DMEM으로 행 A, 열 2 내지 10의 웰에 추가합니다. 5마이크로리터의 양성 및 음성 항혈청제를 대조군으로 웰 A11 및 A12에 추가합니다.

A의 웰에서 50마이크로리터의 용액을 제거하고 그 아래에 있는 모든 웰을 2배 연속 희석합니다. 각 희석에 대해 다중 채널 피펫을 사용하여 기포를 생성하지 않고 위아래로 피펫팅하여 용액을 5-10회 혼합합니다.

연속 희석을 완료한 후 각 컬럼의 마지막 웰에서 마지막 50마이크로리터를 버립니다.

를 분당 500회전으로 1분 동안 원심분리하여 웰 벽에 액체가 남지 않도록 합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 SARS-CoV-2 PV를 희석하는 데 필요한 DMEM의 양을 계산합니다.

석된 PV 용액을 피펫 대야에 혼합하고 세포 전용 대조군을 구성하는 웰 A6 내지 A12를 제외하고 각 웰에 50마이크로리터를 분취합니다. A1 - A6 우물은 PV 전용 제어 역할을 합니다.

벽에 바이러스가 남지 않도록 분당 500회전으로 1분 동안 원심분리 플레이트를 만듭니다. 그런 다음 혈청이 SARS-CoV-2 당단백질과 결합할 수 있도록 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 1시간 동안 배양합니다.

다음으로, ACE2 및 TMPRSS2 플라스미드로 24시간 전에 형질감염된 HEK 293T/17 표적 세포 플레이트를 준비합니다. 플레이트에서 배양 배지를 제거하고 세포 박리를 방지하기 위해 접시의 한쪽에 추가하여 PBS 2밀리리터로 두 번 세척합니다.

PBS를 버리고 플레이트에 트립신 2밀리리터를 추가합니다. 세포가 분리될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다.

세포가 분리된 후, 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 DMEM 6밀리리터를 플레이트에 첨가하여 트립신 활성을 소멸시키고 세포를 부드럽게 재현탁합니다.

자동 세포 계수기를 사용하거나 챔버 슬라이드를 계수하여 세포를 계수합니다. 총 부피 50마이크로리터로 분취된 1 x 10⁴개의 세포를 각 웰에 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 48 내지 72시간 동안 배양합니다.

배양 후, 모든 웰에서 배양 배지를 제거하고 PBS와 상업용 루시페라아제 분석 시약의 1:1 혼합물 25마이크로리터를 추가합니다. 마이크로플레이트 발광계와 함께 상업용 루시페라아제 분석 시스템을 사용하여 플레이트를 판독합니다.

발광계에서 생성된 원시 데이터를 사용하여 텍스트 원고에 설명된 대로 IC50 중화 항체 역가를 계산합니다.