JoVE 실험 백과사전
면역학
0 조회수 • 4:51 분 • July 8th, 2025
테스트 백신으로 코팅된 멀티웰 플레이트로 시작하여 비특이적 상호 작용 부위를 차단합니다.
시험 백신을 주사한 마우스로부터 혈청 샘플을 채취합니다.
이 혈청에는 테스트 백신을 인식하는 항체인 면역글로불린 G 또는 IgG가 포함되어 있습니다.
백신으로 코팅된 웰에 연속적으로 희석된 혈청 샘플을 추가합니다.
IgG는 백신에 결합합니다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척하십시오.
IgG에 결합하는 과산화효소 접합 2차 항체를 추가합니다. 결합되지 않은 2차 항체를 제거합니다.
발색 기질을 추가합니다. 과산화효소는 기질과 상호 작용하여 파란색 생성물을 생성합니다.
반응을 멈추기 위해 산을 도입하십시오. pH의 변화는 용액을 노란색으로 바꿉니다.
분광 광도계를 사용하여 각 웰의 색상 강도를 측정하여 혈청 샘플의 IgG 농도를 결정합니다.
효소 결합 면역흡착 분석 또는 ELISA 플레이트의 항원 코팅의 경우 HI 단백질 항원을 코팅 용액으로 밀리리터당 10마이크로그램으로 희석하고 ELISA 플레이트에 웰당 100마이크로리터의 희석된 항원을 첨가합니다. 플레이트를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 배양 후, 웰당 300마이크로리터의 PBST로 플레이트를 세척합니다.
웰당 300마이크로리터의 밀봉 용액으로 웰을 섭씨 37도에서 2시간 동안 밀봉합니다. 그런 다음 297마이크로리터의 PBST를 첨가하여 각 실험군의 마우스 혈청 3마이크로리터를 100배 희석하고 희석된 혈청을 소용돌이치게 합니다. 각 혈청 샘플에 대해 코팅된 ELISA 플레이트에 웰당 100마이크로리터의 희석된 혈청을 추가합니다. 유사하게, 양성 및 음성 대조군 혈청을 PBST로 100배 희석하고, 4마이크로리터의 양성 또는 음성 대조군 혈청을 396마이크로리터의 PBST에 첨가한 후 와류를 혼합합니다.
이중 비율 희석을 수행하려면 이전에 희석된 실험 혈청 200마이크로리터를 코팅된 ELISA 플레이트의 첫 번째 줄에 추가합니다. 그런 다음 1행과 12행을 제외한 모든 웰에 100마이크로리터의 PBST를 추가합니다. 그런 다음 피펫 건을 100마이크로리터로 조정하고 100마이크로리터의 혈청을 첫 번째 행에서 PBST가 포함된 두 번째 행으로 옮깁니다.
피펫 건을 사용하여 두 번째 행의 내용물을 10회 혼합합니다. 마찬가지로 11행까지 혈청을 1:2 연속적으로 희석합니다. 완료되면 100행에서 11마이크로리터의 액체를 버립니다.
샘플 템플릿에 따라 100마이크로리터의 희석된 음성 및 양성 혈청을 행 12의 각 해당 웰에 추가합니다. ELISA 플레이트를 플라스틱 랩으로 밀봉하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 한편, PBST를 첨가하여 2차 항체 항마우스 IgG HRP를 10,000배 희석한다. 1시간 배양 후, ELISA 플레이트를 웰당 300마이크로리터의 PBST로 세척하여 결합되지 않은 항체를 세척합니다. 그런 다음 희석된 2차 항체 100마이크로리터를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 40분 동안 배양합니다.
웰당 300마이크로리터의 PBST로 플레이트를 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 100마이크로리터의 TMB 발색 용액을 추가합니다. 접시를 섭씨 37도에 놓고 10분 동안 빛을 피하십시오. 그 후 50 마이크로리터의 2몰 황산으로 즉시 반응을 종료합니다. 종료 후 15분 이내에 효소 마커를 사용하여 450나노미터에서 광학 밀도 또는 OD 값을 감지합니다.