0 조회수 • 3:34 분 • July 8th, 2025
카스파제-3를 포함한 여러 카스파제를 생성하는 바이러스에 감염된 포유류 세포부터 시작합니다.
대조군 웰에 성장 배지를 추가하고 카스파제-3 억제제 보충 배지를 테스트 웰에 추가합니다.
대조군 웰에서 카스파제-3는 바이러스 증식에 필수적인 바이러스 핵단백질과 숙주 단백질을 인식하고 분해합니다.
테스트 웰에서 억제제는 세포에 들어가 카스파제-3 활성을 억제하고 단백질 분해를 방지합니다.
플레이트에서 세포를 제거합니다. 용해 시약을 첨가하고 가열하여 세포 용해를 유도하여 세포내 단백질을 방출합니다.
두 샘플을 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 로드하고 전기영동하여 크기에 따라 단백질을 분리합니다.
전기영동 후 겔을 블로팅 멤브레인으로 옮깁니다.
바이러스 핵단백질 및 숙주 단백질에 대한 1차 항체로 막을 처리합니다.
1차 항체와 결합하는 형광단 접합 2차 항체로 세척하고 오버레이하여 형광 밴드를 생성합니다.
테스트 샘플에서 더 높은 형광은 대조군에 비해 카스파제-3 매개 바이러스 및 숙주 단백질 절단이 감소했음을 나타냅니다.
시작하려면 12웰 세포 배양 플레이트에 MDCK 또는 A549 세포를 시딩하고 5% 이산화탄소 분위기에서 섭씨 37도에서 밤새 세포를 배양합니다. 다음날, 세포에서 오래된 배양 배지를 제거하고 1밀리리터의 무혈청 MEM으로 각 웰의 세포를 두 번 세척합니다.
그런 다음 400마이크로리터의 인플루엔자 A 바이러스 접종물을 첨가하여 세포를 감염시키고 플레이트를 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 바이러스 접종물을 제거하고 세포를 MEM으로 세척합니다. 각 웰에 무혈청 MEM 1밀리리터를 추가하고 이전 단계에서 설명한 대로 세포를 배양합니다.
24시간 후, 1밀리리터 주사기 플런저로 세포를 긁어서 수확하고 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 튜브를 실온에서 2분 동안 12,000g에서 원 심분리하고 상청액을 수집합니다. 250마이크로리터의 인산염 완충 식염수와 원심분리기로 세포 펠릿을 세척합니다. 상청액을 제거하고 100마이크로리터의 세포 용해 완충액을 추가합니다. 소용돌이로 혼합합니다.
튜브를 섭씨 98도에서 10분 동안 가열하여 세포를 완전히 용해시킵니다. 그런 다음 표준 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 통해 감염되지 않은 샘플과 감염된 샘플에서 동일한 양의 단백질을 분리합니다. 전기영동 후 단백질 겔을 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인으로 옮기고 웨스턴 블로팅을 수행합니다. 모의 처리된 샘플과 억제제로 처리된 감염된 샘플 레인의 단백질 수준을 비교합니다.