JoVE 실험 백과사전
면역학
0 조회수 • 4:02 분 • July 8th, 2025
박테리아 샘플이 들어 있는 분석 튜브를 가져갑니다.
테스트 샘플에 억제제 분자를 첨가하여 박테리아의 항생제 유출 펌프를 차단합니다.
원심분리하여 상청액을 버립니다.
박테리아 세포에 들어가는 형광단 접합 항생제 프로브를 추가합니다.
대조군 샘플에서 유출 펌프는 프로브를 세포외 배지로 압출합니다.
억제제 처리된 샘플에서 막힌 유출 펌프는 프로브를 배출할 수 없어 프로브가 축적됩니다.
샘플을 원심분리합니다. 세포외 프로브가 포함된 상청액을 버립니다.
용해 완충액을 첨가한 다음 리소자임을 첨가하여 박테리아 세포벽을 약화시킵니다.
동결-해동 주기, 초음파 처리 및 고온 노출을 수행하여 세포를 용해합니다.
원심 분리기. 상청액을 필터 멤브레인으로 옮깁니다.
프로브가 들어 있는 여과액을 세척하고 수집합니다.
여과액의 형광 강도를 측정합니다.
억제제로 처리된 박테리아 샘플에서 더 높은 형광 강도는 유출 기능의 상실을 시사하여 세포내 프로브 축적을 초래합니다.
프로브 축적 분석을 위해 박테리아 균주의 글리세롤 스톡을 LB 한천 플레이트에 줄무늬로 줄무늬로 만들어 섭씨 37도에서 하룻밤 배양합니다. 다음날 아침, 섭씨 37도의 용원성 국물에서 하룻밤 배양하기 위해 접시에서 단일 콜로니를 선택합니다. 다음날 아침, 하룻밤 배양액을 신선한 배지에서 약 50배 희석합니다.
배양이 중간 로그 단계에 도달하면 원심분리로 박테리아를 펠릿화하고 배지를 디캔팅합니다. 박테리아를 PBS 1밀리리터에 재현탁하고 박테리아를 다시 원심분리합니다. 상청액을 디캔팅하고 세척된 펠릿을 PBS에 재현탁하여 2의 600나노미터에서 광학 밀도로 재현탁합니다.
10.1 마이크로리터의 PBS 10밀리몰 CCCP 박테리아를 1밀리리터의 박테리아에 첨가하고 박테리아를 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 원심분리에 의해 박테리아를 수집하고 PBS에 10-100마이크로몰 형광 항생제 용액 1밀리리터에 펠릿을 재현탁합니다.
섭씨 37도에서 30분 동안 배양한 후, 세척당 1밀리리터의 차가운 PBS에 원심분리하여 세포를 4회 세척합니다. 세척 후 180마이크로리터의 용해 완충액과 70마이크로리터의 리소자임으로 박테리아를 용해합니다.
섭씨 37도에서 30분 후, 섭씨 영하 78도에서 각각 5분, 섭씨 34도에서 15분 동안 세 번 동결해동합니다. 마지막 동결 해동 후 샘플을 20 분 동안 초음파 처리한 다음 섭씨 65도에서 30 분 동안 배양합니다.
배양이 끝나면 원심분리를 통해 용해된 샘플을 수집하고 10킬로달톤 필터 멤브레인을 통해 튜브 내용물을 걸러냅니다. 세척당 100마이크로리터의 물로 필터를 4회 세척하고 각 세척액을 검은색 평평한 바닥 96웰 플레이트의 개별 웰에 분취합니다. 그런 다음 형광단에 적합한 여기 및 방출 파장으로 플레이트 리더에서 형광 강도를 측정합니다.