식물 잎에서 히스톤 수정을 감지

특정 식물 유전자 히스톤 수정을 감지하는 신뢰할 수있는 유용한 접근 방법이 설명되어 있습니다. 접근 방식은 염색질 immunoprecipitation (칩)와 실시간으로 양적 PCR을 결합하여. 그것은 다양한 생리 과정에서 역할과 특정 유전자 히스톤 수정을 감지 수 있습니다.

다음 방법은 선택한 식물 유전자에서 특정 염색질 변형을 신뢰할 수 있고 민감하게 검출할 수 있습니다. 첫째로 포름알데히드로 변경한 히스톤 그리고 DNA를 교차 결합. 그런 다음 염색질을 추출하고 초음파 처리하여 변형 특이적 항체로 면역침전을 촉진합니다.

마지막으로 히스톤 DNA 복합체와 유전자 특이적 실시간 정량 PCR의 찌꺼기 연결에 의한 칩 반응을 분석합니다. 식물에서 이 접근 방식은 미로에서 C 4 광합성 및 애기장대에서 전신 면역과 관련된 특정 히스톤 변형과 같은 분자 통찰력을 제공할 수 있습니다. 화성 분광법과 같은 기존 방법에 비해 염색질 면역침전의 주요 장점은 이 기술을 통해 식물 게놈에 대한 선택된 염기서열에서 히스턴 변형을 검출할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 프로토콜이 올바른 성능이 절차의 성공에 핵심이 되는 몇 가지 단계를 수반하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 비디오에서는 칩 분석을 사용하여 모델 식물 애기장대 ANA의 유전자 발현 조절 완화에 대한 통찰력을 제공하며, 절차를 시연하는 것은 박사 과정 학생인 mic yakovich가 각 샘플에 대해 애기장대 잎 2g과 50ml 플라스틱 튜브를 수확하는 것으로 시작합니다. 40ml 표시를 가교 완충액으로 채우고 완충 표면 바로 위에 맞춤형 필터 스폰지를 배치하여 잎이 잠겨 있도록 합니다.

이제 샘플을 진공 건조제에 넣고 10분 동안 여과합니다. 가교 반응을 중지하려면 2.5ml의 2몰 글리신을 넣고 반전으로 혼합합니다. 그런 다음 5분 동안 다시 침투하고, 진공 청소기를 계속하고, 다시 5분 동안 침투합니다.

그런 다음 체에서 잎을 수확하는 동안 액체를 버리십시오. 플라스틱 비커에 물 1리터를 넣고 잎을 두 번 씻은 후 종이 타월로 잎을 완전히 말리고 새 플라스틱 튜브에 잎을 모아 액체 질소로 얼립니다. 염색질이 분리될 때까지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

액체 질소 냉각 모르타르와 유봉을 사용하여 냉동 샘플을 미세한 분말로 분쇄합니다. 분말을 50ml 플라스틱 튜브에 옮깁니다. 추출 완충액 1번 30ml에 분말을 현탁시키고 오버헤드 셰이커에서 섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다.

서스펜션을 4겹의 거울 천을 통해 새 50ml 플라스틱 튜브에 통과시킵니다. 원심분리 후 SUP 나틴을 버립니다. 다음으로, 페인트 브러시를 사용하여 펠릿을 50마이크로리터의 추출 버퍼 2번에 다시 현탁시킨 다음 950마이크로리터의 추출 버퍼를 추가합니다.

둘째, 현탁액을 1.5ml 마이크로 퍼지 튜브로 옮기고 10분 동안 원심분리기를 합니다. 한편, 1.5ml의 추출 버퍼를 포함하는 2개의 밀리리터 마이크로 퍼지 튜브를 준비합니다. 세 번째.

다음으로, 상등액을 버리고 펠릿을 300마이크로리터의 추출 완충액에 서서히 현탁시킵니다. 세 번째. 먼저 작은 부피의 버퍼를 추가합니다.

셋째, 페인트 브러시로 펠릿을 매달아 놓고 나머지 버퍼를 추가합니다. 이제 1.5ml의 추출 버퍼가 들어 있는 준비된 튜브 위에 샘플을 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 세 번째, 두 단계가 섭씨 4도에서 16, 000 번 G에서 1 시간 동안 원심 분리기 샘플을 혼합하지 않도록합니다.

sup natin을 버리고 300 마이크로 리터의 초음파 처리 완충액 염색질에 페인트 브러시로 염색질 펠릿을 약 400 염기 쌍의 DNA 크기로 현탁시킵니다. 초음파 처리 할 때 염색질이 약 섭씨 30도 이상으로 가열되지 않는지 확인하십시오. 열에 민감한 가교를 보호하기 위해 초음파 샘플을 원심 분리하여 미용해 물질을 침전시키고 상등액을 단백질 아가로스와 항체 결합 완충액을 포함하는 2밀리리터 마이크로 fuge 튜브로 수확합니다.

200마이크로리터의 샘플 염색질 제제를 추가합니다. 오버헤드 쉐이커에서 튜브를 1시간 동안 배양합니다. 원심분리 후 샘플 상등액을 수확하고 단백질 30마이크로리터를 분취합니다.

입력 물질의 염색질 농도를 측정하기 위해 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 대한 A. 40 마이크로 리터의 초음파 처리 된 염색질을 예약하십시오. 그런 다음 30 마이크로 리터의 단백질 aros에 400 마이크로 리터의 초음파 처리 된 염색질 현탁액을 추가하고 적절한 양의 변형 특이 항체를 섭씨 4도의 오버 헤드 셰이커에서 밤새 배양합니다.

440 회 G.Remove에 2 분 동안 ification에 의하여 구슬을 가을걷수 및 머리 위 셰이커에 각각 완충기의 900 microliters를 가진 구슬 펠릿의 연속적인 10 분 세척을 실행하십시오. 최종 세척 후 남아 있는 버퍼를 완전히 제거합니다. 히스톤에서 DNA를 분리하려면 비드에 400마이크로리터의 D 교차 결합 버퍼를 추가하고 5분 동안 이전 소용돌이를 보존한 40마이크로리터 입력 샘플을 원심분리 샘플로 만들고 밤새 섭씨 65도에서 배양합니다.

이제 상용 DNA 정제 키트로 DNA를 정제하고 기존의 유전자 좌위 특이적 실시간 정량 R-T-P-C-R을 수행합니다. 이 예에서 애기장대 ANA PR 2 방어 유전자의 발현은 식물 호르몬 살리실산의 합성 유사체인 Benzo Diaz ole에 의해 유도되었습니다. 결과는 PR 2 발현의 활성화가 PR 2 프로모터에서 히스톤 H 3 및 H 4에 대한 라이신 잔기의 아세틸화 증가와 관련이 있음을 보여줍니다.

이 절차를 시도하는 동안 잎 가루에 추출 완충액 1을 추가하면 닫힌 fcon 튜브에 과도한 압력이 발생한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 가끔씩 튜브를 여는 것을 잊지 마십시오. 또한 다음 버퍼를 추가하기 전에 펠릿을 현탁한 후 페인트 브러시를 제거하지 마십시오.

이 비디오를 시청한 후에는 DNA와 히스톤의 알데히드 기반 가교결합, 염색질 면역침전의 분리 및 유전자좌 특이적 DNA 정량화를 형성하여 식물 생물학의 다양한 분야에서 염색질의 역할과 그 변형에 대한 주요 질문에 답하기 위해 히손 변형 및 일반 레버를 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.