Name: 식물 잎에서 히스톤 수정을 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 배우세요 식물 유전자에서 히스톤 수정을 검출하는 크로마틴 면역침전법을 Arabidopsis를 이용하여. 이 방법은 광합성과 면역 반응 관련 유전자 발현 조절 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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<p class="jove_content"> 이 작품은 독일 과학 재단 (DFG)와 독일의 연방 및 주 정부의 우수 이니셔티브에 의해 투자되었다. </p>

<p class="jove_title"> 1. 식물 재료의 Crosslinking </p><ol><li> 하베스트 1~2g Arabidopsis 50 - ML 플라스틱 튜브에 단풍 (6 10cm의 로제트 직경에) 및 crosslinking 버퍼와 40mL까지 기입니다. </li><li> 단풍이 버퍼 표면 위에 맞춤형 필터 스폰지 권리를 때우는하여 예를 들어, 포장되어있어 있는지 확인합니다. 다음 건조기에 튜브를 삽입합니다. </li><li> 진공은 10 분에 대한 침투. 각 튜브는 crosslinking를 중지 2M 글리신의 2.5mL를 추가하고, 글리신의 동일한 분산을 보증하기 위해 튜브를 반전. </li><li> 진공 다른 5 분에 대한 침투와 체에 잎을 수확하는 동안 액체를 폐기하십시오. </li><li> 워시는 다음 유리 비커에 물 1L, 철저하게 종이 타올로 건조 잎 두 잎. </li><li> 새로운 플라스틱 튜브에 잎사귀를 수집하고 액체 질소에 냉동. 스토어 -80 시에 출발 ° C까지 염색질 절연. </li></ol><p class="jove_title"> 2. 염색질의 분리 </p><ol><li> 단풍은 사용까지 액체 질소에 보관되었습니다 박격포와 암술과 지상되었습니다. </li><li> 50 - ML 플라스틱 튜브에 분말을 전송하고 30mL 추출 버퍼 # 1 일시 중지합니다. </li><li> 오버헤드 흔드는에 4 ° C에서 15 분에 대해 품어. </li><li> 새로운 50 ML 플라스틱 튜브에 miracloth 네 가지 레이어를 통해 여과물 서스펜션. </li><li> 4 2,800 XG에서 20 분에 대한 회전 ° C. </li><li> 뜨는 제거하고 1mL 추출 버퍼 # 2에서 페인트 브러시와 펠렛을 일시 중지합니다. 처음엔 페인트 브러시와 펠렛을 중지하고 버퍼의 나머지 부분을 추가, 버퍼 # 2의 작은 볼륨을 추가합니다. </li><li> 4 12,000 XG에서 10 분에 1.5mL microfuge 관과 스핀으로 정지를 전송 ° C. </li><li> 한편, 1.5mL 추출 버퍼 # 3를 포함하는 2mL - microfuge 튜브를 준비합니다. </li><li> 스펀 튜브 (2.7 단계)에서 뜨는 제거하고 추출 버퍼 # 3 300μL의 펠렛을 일시 중지합니다. 첫째, 버퍼 # 3의 작은 볼륨을 추가 페인트 브러시와 펠렛을 중지하고 나머지 버퍼를 추가합니다. </li><li> 조심스럽게 pipet 단계 2.8 준비 1.5 ML 추출 버퍼 # 3 위에 펠렛을 (단계 2.9) 중지. 두 단계가 혼합되지 않습니다 있는지 확인합니다. 4 16,000 XG에서 1 시간을 위해 스핀 ° C. </li><li> 뜨는 제거하고 sonication 버퍼의 300μL의 페인트 브러시와 염색질 펠렛을 일시 중지합니다. </li><li> 약 400bp의 DNA를 크기에, sonotrode와 함께, 또는 초음파 욕조에서 염색질을 Sonicate. sonicating 때, 반드시 염색질이 약 30 이상 가열되지 않습니다 ° C는 열에 민감한 crosslinks를 보호하기 위해합니다. sonication의 기간은 다른 sonication 장치 사이에 상당히 차이가 있기 때문에, 실험적으로 결정되어야합니다. 지도 들어, 두 개의 다른 장치에 대한 설정이 제공됩니다 : </li></ol><p class="jove_content"> 0.6mL microfuge 튜브에 Bandelin 브랜드 sonotrode 노출 염색질 25 % 파워 사이클 = 50 설정으로 다섯 번 20 파열과 sonication하십시오. 얼음 욕조에 매 20 <sup>번째</sup> 파열 후에 이렇게하는 동안, 쿨 샘플. </p><p class="jove_content"> Diagenode Bioruptor 초음파 욕조와 sonication을 위해, 물, 얼음 욕조를 입력하고 '높음'설정을 1.5mL microfuge 튜브에서 30 초 동안 열번 sonicate. 매 30 초 후에 다른 30 ​​초 동안 냉각 샘플. </p><ol start="13"><li> 스핀은 4 1만6천g에서 5 분에 대한 샘플을 sonicated ° C 소화 되 다만 자료를 촉진합니다. 뜨는 직접 immunoprecipitation 사용할 수 있습니다. 또한, 샘플은 액체 질소에 냉동과 ° C까지 추가로 사용하여 -80에 저장된 충격하실 수 있습니다. </li></ol><p class="jove_title"> 3. Immunoprecipitation </p><ol><li> 40μL 단백질 - 항체 결합 버퍼의 아가로 오스와 1.8mL.을 포함하는 2 - ML의 microfuge 튜브 준비 염색질의 준비 200μL (2.13 단계)를 추가합니다. </li><li> 오버헤드 흔드는에 1 시간을위한 튜브를 품어. </li><li> 단백질 - 아가로 오스 비즈를 버리고 immunoprecipitation을위한 뜨는 사용합니다. </li><li> 염색질 농도를 ( '입력')를 확인하는 40μL - 나누어지는을 제거합니다. </li><li> 추가 30μL 단백질 - 아가로 오스와 400μL sonicated 염색질 서스펜션에 특정 시약 및 장비의 아래 테이블에 표시됩니다 수정 - 특정 항체의 금액입니다. </li><li> 4 오버헤드 흔드는에 2.5h 또는 야간에 대해 품어 ° C. </li><li> 440 X G.에서 2min을 위해 구슬을 스핀 </li><li> 각 세척 버퍼 900μL (아래 목록 참조) 비드 펠렛 씻으십시오. 각 버퍼 들어, 4 오버헤드 흔드는 ° C에 10 분에 대한 버퍼에 품어 구슬 다음, 440 XG에서 2min에 대한 스핀 뜨는 삭제하고 다음 버퍼를 추가합니다. <ol><li> 낮은 소금 세척 버퍼 </li><li> 고 염분 세척 버퍼 </li><li> LiCl 세척 버퍼 </li><li> TE 세척 버퍼 </li></ol></li><li> 최종 세척 후 완전히 남아있는 버퍼를 제거합니다. </li></ol><p class="jove_title"> 4. histones과 DNA의 드 - crosslinking, 그리고 시켰던 DNA의 정화 </p><ol><li> 아가로 오스 펠렛 및 단계 3.4에서 40μl '입력'샘플, 소용돌이 믹서에서 5 분을위한 혼합, 회전 샘플 및 incu에 드 crosslinking 버퍼 100μL 추가° C 야간 65 덜다. </li><li> 상업 DNA 또는 PCR 정화 키트와 함께 DNA 정화. </li><li> 일반적으로 최종 열 eluate의 1시 5분 희석의 5μl가 수행하는 충분 기존의 현장 특정 실시간 정량 RT - PCR (RT - qPCR). </li></ol><p class="jove_title"> 5. 버퍼 표 </p><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Crosslinking 버퍼</strong> </td></tr><tr><td> 나트륨 butyrate </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 400mM </td></tr><tr><td> 트리스 - HCL, pH를 8.0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> β - 메르 캅 토 에탄올 </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> 포름 알데히드 </td><td> 3퍼센트 (V / V) </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>추출 버퍼 # 1</strong> </td></tr><tr><td> 나트륨 butyrate </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 400mM </td></tr><tr><td> 트리스 - HCL, pH를 8.0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> β - 메르 캅 토 에탄올 </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> 완료 테아제 억제제 </td><td> 1X </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>추출 버퍼 # 2</strong> </td></tr><tr><td> 나트륨 butyrate </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 250mM </td></tr><tr><td> 트리스 - HCL, pH를 8.0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> β - 메르 캅 토 에탄올 </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2</sub> </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> 트리톤 X - 100 </td><td> 1퍼센트 (W / V) </td></tr><tr><td> 완료 테아제 억제제 </td><td> 1X </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>추출 버퍼 # 3</strong> </td></tr><tr><td> 나트륨 butyrate </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 1.7M </td></tr><tr><td> 트리스 - HCL, pH를 8.0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> β - 메르 캅 토 에탄올 </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2</sub> </td><td> 2mM </td></tr><tr><td> 트리톤 X - 100 </td><td> 0.15 % (W / V) </td></tr><tr><td> 완료 테아제 억제제 </td><td> 1X </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Sonication 버퍼</strong> </td></tr><tr><td> 트리스 - HCL, pH를 8.0 </td><td> 25mM </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - NaOH, pH를 8.0 </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.5 % (W / V) </td></tr><tr><td> 완료 테아제 억제제 </td><td> 1X </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>항체 결합 버퍼</strong> </td></tr><tr><td> 트리스 - HCL, pH를 8.0 </td><td> 50mM </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - NaOH, pH를 8.0 </td><td> 1mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150mM </td></tr><tr><td> 트리톤 X - 100 </td><td> 0.1 % (W / V) </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>낮은 소금 세척 버퍼</strong> </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150mM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.1 % (W / V) </td></tr><tr><td> 트리톤 X - 100 </td><td> 1퍼센트 (W / V) </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - NaOH, pH를 8.0 </td><td> 2mM </td></tr><tr><td> 트리스 - HCL, pH를 8.0 </td><td> 20mM </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>고 염분 세척 버퍼</strong> </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 500mM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.1 % (W / V) </td></tr><tr><td> 트리톤 X - 100 </td><td> 1퍼센트 (W / V) </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - NaOH, pH를 8.0 </td><td> 2mM </td></tr><tr><td> 트리스 - HCL, pH를 8.0 </td><td> 20mM </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>LiCl 세척 버퍼</strong> </td></tr><tr><td> 염화 리튬 </td><td> 250mM </td></tr><tr><td> Nonidet - P40 </td><td> 1퍼센트 (V / V) </td></tr><tr><td> 나트륨 desoxycholate </td><td> 1퍼센트 (W / V) </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - NaOH, pH를 8.0 </td><td> 1mM </td></tr><tr><td> 트리스 - HCL, pH를 8.0 </td><td> 20mM </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>TE 세척 버퍼</strong> </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - NaOH, pH를 8.0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> 트리스 - HCL, pH를 8.0 </td><td> 1mM </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Decrosslinking 버퍼</strong> </td></tr><tr><td> 트리스 - HCL, pH를 6.8 </td><td> 62.5mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 200mM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 2퍼센트 (W / V) </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 10mM </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> 6. 대표 결과 : </p><p class="jove_content"> <em>Arabidopsis thaliana PR2 방어</em> 유전자 표현 β를 인코딩항균 활성 <sup>12과</sup> 1,3 - 글루 카 네이스는 benzothiadiazole (BTH), 식물 호르몬 살리실산 <sup>3</sup> 합성 아날로그에 의해 유발되었다. <strong>그림 1</strong> <em>PR2</em> 표현의 활성화를 보여줍니다 히스톤에 리신 잔류물의 아세틸화 증가와 관련된 <em>PR2</em> 모터에 H3 및 H4. nucleosome 밀도는 유전자 활성화 <sup>13시</sup> 감소 때문에, 히스톤 아세틸화 값 히스톤 3 불변량 지역 항체로 얻은 신호 표준되었습니다. </p><p class="jove_content"><img src="/files/ftp_upload/3096/3096fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"><br> <strong>그림 1 BTH는 Arabidopsis에 <em>PR2</em> 모터에 히스톤 아세틸화을 유도.</strong> 식물은 100μM BTH 또는 wettable 분말 컨트롤과 함께 치료를했다. 72h 후, 단풍이 수집되었고 염색질은 고립되었다. 아세틸화 특정 항체 (같은 그림에 표시된)와 강수량 후 얻은 신호는 히스톤 H3의 불변량 도메인에 항체와 석출하여 얻은 신호 표준되었습니다. 시켰던 염색질은 RT - qPCR에 의해 계량했다. 데이터 BTH 치료의 부재에서 히스톤 수정 수준 표준화하고 있습니다. </p>

<ol><li>Eberharter, A., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation%3A+a+switch+between+repressive+and+permissive+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+rep%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin.</a> <em>EMBO rep</em>. <strong>3</strong>, 224-229 (2002).</li>
<li>Ruthenburg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+lysine+4+on+histone+H3%3A+intricacy+of+writing+and+reading+a+single+epigenetic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic.</a> <strong>25</strong>, 15-30 (2007).</li>
<li>Jaskiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+acts+as+a+memory+for+systemic+acquired+resistance+in+the+plant+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+rep%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response.</a> <em>EMBO rep</em>. <strong>12</strong>, 50-55 (2011).</li>
<li>Ng, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+histone+modifications+are+associated+with+transcriptional+poising+and+activation+of+the+phaseolin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>18</strong>, 119-132 (2006).</li>
<li>Offermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumination+is+necessary+and+sufficient+to+induce+histone+acetylation+independent+of+transcriptional+activity+at+the+C4-specific+phosphoenolpyruvate+carboxylase+promoter+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize.</a> <em>Plant Physiol</em>. <strong>141</strong>, 1078-1088 (2006).</li>
<li>Deng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+histone+acetyltransferase+AtHAC1+in+the+regulation+of+flowering+time+via+repression+of+FLOWERING+LOCUS+C+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis.</a> <em>Plant Physiol</em>. <strong>143</strong>, 1660-1668 (2007).</li>
<li>Benhamed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+GCN5%2C+HD1%2C+and+TAF1%2FHAF2+interact+to+regulate+histone+acetylation+required+for+light-responsive+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>18</strong>, 2893-2903 (2006).</li>
<li>Bowler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+techniques+for+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Chromatin techniques for plant cells.</a> <em>Plant Journal</em>. <strong>39</strong>, 776-789 (2004).</li>
<li>Orlando, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+chromosomal+proteins+in+vivo+by+formaldehyde+decrosslinked-chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation.</a> <em>Trends Biochem. Sci</em>. <strong>25</strong>, 99-104 (2000).</li>
<li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Meth%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> <em>Plant Meth</em>. <strong>3</strong>, 11-11 (2007).</li>
<li>Danker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+information+but+not+promoter+activity+controls+the+methylation+state+of+histone+H3+lysine+4+on+two+photosynthetic+genes+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize.</a> <em>Plant J</em>. <strong>53</strong>, 465-474 (2008).</li>
<li>Uknes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+resistance+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Acquired resistance in Arabidopsis.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>4</strong>, 645-656 (1992).</li>
<li>Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+displacement+in+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Develop%22%5BJournal%5D)">Nucleosome displacement in transcription.</a> <em>Genes Develop</em>. <strong>20</strong>, 2009-2017 (2006).</li>
</ol>

<p class="jove_content"> 프로토콜의 가장 중요한 단계는 재료의 분쇄와 염색질의 sonication, DNA와 histones, 유형 및 잎 소재의 금액의 crosslinking 수 있습니다. 이러한 문제의 자세한 내용을 보려면 심판을 참조하십시오. 9 10. </p><p class="jove_step"> Sonication 및 crosslinking : </p><p class="jove_content"> 400bp 약 조각 sonication 동안 염색질을 방해하는 것이 중요합니다. 부족한 sonication 오래 염색질의 조각을 떠날 것입니다 반면 철저한 sonication은 DNA와 histones을 방해하여 염색질을 파괴합니다. 테스트 현장에서 말초 히스톤 수정을 로컬 변경에서 차별 수 없기 때문에 이들은 방법의 특이성에 영향을줍니다. Sonication 효율이 가장 DNA를 분리하고 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 가지각색으로 DNA의 길이를 결정, 전에 sonication, DE - crosslinking의 DNA와 histones 후 샘플에서 20μL 염색질을 수집하여 테스트됩니다. 염색질 준비가 아직 조각난 DNA의 시각화를 방해할 수도 정화의이 단계에서 RNA의 대량 포함되어 있기 때문에 RNAse는 전기하기 전에 샘플에 추가되어 있어야합니다. 비 가지각색 염색질의 DNA가 10kbp 이상인 경우 가지각색 염색질의 DNA가 DNA의 400bp 주변의 최대 신호 강도와 얼룩을 형성 반면 샘플은 염색질 immunoprecipitation하는 데 유용합니다. </p><p class="jove_content"> 우리는 일상적으로 그대로 단풍의 염색질 crosslinking 3 % (V / V) 포름 알데히드를 사용하지만 1% (V / V) 포름 알데히드는 대부분의 경우 충분 수도 있습니다. 우리 손에, 낮은 포름 알데히드 농도는 결과의 PCR 반응에서 짧은 sonication 시간 및 배경 신호 수 있습니다. 그러나 포름 알데히드의 부족 금액은 자주 독립 실험 사이 PCR 신호의 낮은 재현성의 결과. 이것은 낮은 농도에서 포름 알데히드와 나뭇잎의 부족 침투에 의한 것입니다. 화합물이 시간과 중합하는 경향으로 자주 포름 알데히드 주식을 교환해야합니다. 포름 알데히드 솔루션은 약 한 달 동안 안정하고 있으며,이 기간은 거의 메탄올 안정화에 의해 연장되지 않습니다. 이것은 실험 조건을 설정할 때 다른 포름 알데히드 농도를 테스트하는 것이 좋습니다. </p><p class="jove_step"> 식물 재료의 금액 및 연삭 : </p><p class="jove_content"> 서로를 지키는 나뭇잎을 피하기 위해 버퍼의 큰 볼륨의 잎 소재의 낮은 금액을 침투하는 것이 중요합니다. 나뭇잎이 포름 알데히드의 부족 침투에 자주 결과를 집어넣는. 또한, 너무 많이 식물 재료 miracloth 조직의 모공을 차단합니다. 분쇄 효율이 상당히 완벽하게 맞지과 박격포와 유봉을 사용하여에 따라 달라집니다. 우리는 일상적으로 추가 액체 질소의 부재에 액체 질소 냉각 유봉과 박격포와 함께 갈아 50초 세 번 자료가 벌금 파우더로 그라운드 때까지. </p>

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 단백질 - A - 아가로 오스 </td><td> 호슈 </td><td> 11 134 515 001 </td><td> 항체 클래스에 따라 달라집니다 </td></tr><tr><td> 단백질 G - 아가로 오스 </td><td> 호슈 </td><td> 11 243 233 001 </td><td> 항체 클래스에 따라 달라집니다 </td></tr><tr><td> 안티 hyperacetyl - H4 </td><td> Millipore </td><td> 06-946 </td><td> 우리는 5μL을 사용 </td></tr><tr><td> 안티 - 아세틸 - H4K5 </td><td> Millipore </td><td> 07-327 </td><td> 우리는 5μL을 사용 </td></tr><tr><td> 안티 - 아세틸 - H4K8 </td><td> Millipore </td><td> 07-328 </td><td> 우리는 5μL을 사용 </td></tr><tr><td> 안티 - 아세틸 - H4K12 </td><td> Millipore </td><td> 07-595 </td><td> 우리는 5μL을 사용 </td></tr><tr><td> 안티 - 아세틸 - H4K16 </td><td> Millipore </td><td> 07-329 </td><td> 우리는 5μL을 사용 </td></tr><tr><td> 안티 - 아세틸 - H4K18 </td><td> Millipore </td><td> 07-354 </td><td> 우리는 1μL을 사용 </td></tr><tr><td> 안티 - 아세틸 - H3K9 </td><td> Millipore </td><td> 07-352 </td><td> 우리는 5μL을 사용 </td></tr><tr><td> 안티 - 아세틸 - H3K14 </td><td> Millipore </td><td> 07-353 </td><td> 우리는 1μL을 사용 </td></tr><tr><td> 안티 trimethyl - H3K4 </td><td> Diagenode </td><td> PAB - 003-50 </td><td> 우리는 5μL을 사용 </td></tr><tr><td> 안티 - 디메틸 - H3K4 </td><td> Millipore </td><td> 07-030 </td><td> 우리는 5μL을 사용 </td></tr><tr><td> 안티 모노 메틸 - H3K4 </td><td> Abcam </td><td> ab8895 </td><td> 2,5 - 10μL </td></tr><tr><td> 안티 H3 </td><td> Abcam </td><td> ab1791 </td><td> 우리는 히스톤 밀도를 확인 1μL를 사용 </td></tr><tr><td> Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD - 200 </td><td></td></tr><tr><td> Sonotrode MS72 </td><td> Bandelin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miracloth </td><td> Calbiochem </td><td> 475855 </td><td></td></tr><tr><td> 완료 테아제 억제제 </td><td> 호슈 </td><td> 11836145001 </td><td></td></tr></tbody></table>

식물 잎에서 히스톤 수정을 감지

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

<p class="jove_content"> 염색질 구조 eukaryotes에서 유전자 발현의 조절에 중요​​합니다. 이 과정에서, histones H3 및 H4의 아미노 터미널 꼬리에 염색질의 리모델링, DNA의 methylation과 공유 결합 수정 필수적 역할 <sup>1-2</sup> 재생합니다. H3 및 H4 히스톤 수정 리신과 아르기닌의 methylation, 라이신의 아세틸화, 그리고 세린의 잔류물 <sup>1-2의</sup> 인산화을 포함합니다. 이러한 수정은 유전자 활성화, 탄압, 또는 적절한 신호 (미생물 - 관련 분자 패턴, 빛, 호르몬 등) <sup>3-7의</sup> 인식 후 표현보다 신속하고 강력한 인증을 지원하는 유전자의 상태와 준비하는 중 연결됩니다. </p><p class="jove_content"> 여기, 우리는 선택된 식물 유전자에서 특정 염색질 변경의 신뢰성과 민감한 검출을위한 방법을 제시한다. 기술은 수정 - 특정 항체 <sup>9,10와</sup> 포름 알데히드 <sup>8,9,</sup> 추출 및 염색질, 염색질 immunoprecipitation (칩)의 sonication과 (수정) histones과 DNA의 crosslinking 기반으로, 히스톤 - DNA의 단지의 드 - crosslinking, 그리고 유전자 특정 실시간 정량 PCR. 접근 방식은 C <sub>네</sub> 옥수수 <sup>5,11의</sup> 광합성과 Arabidopsis <sup>3</sup> 체계 면역과 관련된 특정 히스톤 변경을 감지하는 데 유용합니다 입증되었습니다. </p>

<p class="jove_content">특정 식물 유전자 히스톤 수정을 감지하는 신뢰할 수있는 유용한 접근 방법이 설명되어 있습니다. 접근 방식은 염색질 immunoprecipitation (칩)와 실시간으로 양적 PCR을 결합하여. 그것은 다양한 생리 과정에서 역할과 특정 유전자 히스톤 수정을 감지 수 있습니다.</p>

염색질 구조는 진핵생물의 유전자 발현 조절에 있어 중요합니다. 이 과정에서 염색질 리모델링, DNA 메틸화 및 공유 결합...

<p>다음 방법은 선택된 식물 유전자의 특정 염색질 수식(chromatin modification)을 신뢰성 있고 민감하게 검출할 수 있게 해줍니다. 먼저 포름알데히드를 사용하여 수식된 히스톤과 DNA를 가교 결합시킵니다. 그 후, 염색질을 추출하고 초음파 처리하여 수식 특이적 항체를 이용한 면역침강이 용이하도록 합니다.</p><p>마지막으로, 히스톤-DNA 복합체의 교차 결합(cross-linking) 및 유전자 특이적 실시간 정량 PCR(real-time quantitative PCR)을 통해 ChIP 반응을 분석합니다. 식물에서 이 접근 방식은 옥수수의 C4 광합성이나 애기장대의 전신 면역과 관련된 특이적 히스톤 변형과 같은 분자적 통찰력을 제공할 수 있습니다. 질량 분석법과 같은 기존 방법보다 크로마틴 면역침강법이 갖는 주요 장점은, 이 기술을 통해 식물 게놈 내의 선택된 서열에서 히스톤 변형을 검출할 수 있다는 점입니다.</p><p>일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 프로토콜 내에 절차의 성공을 좌우하는 핵심 단계들이 포함되어 있어 어려움을 겪을 수 있습니다. 본 영상에서는 모델 식물인 Arabidopsis ANA의 유전자 발현 조절 이상에 대한 통찰을 제공하기 위해 칩 분석(chip analysis)을 사용하며, 시연은 박사 과정 학생인 mic yakovich가 진행합니다. 각 시료에 대해, 50 mL 플라스틱 튜브에 2 g의 Arabidopsis 잎을 수확하여 넣는 것으로 시작하십시오. 40 mL 표시선까지 가교 버퍼(crosslinking buffer)를 채우고, 잎이 계속 잠겨 있도록 버퍼 표면 바로 위에 맞춤형 필터 스펀지를 배치하십시오.</p><p>이제 샘플을 진공 데시케이터에 넣고 10분 동안 침투시키십시오. 가교 반응을 중단시키기 위해 2 M glycine 2.5 mL를 첨가하고 반전 혼합하여 섞어줍니다. 그 후 다시 5분 동안 침투시키고, 계속 진공 상태를 유지하며 5분 더 침투시킵니다.</p><p>그 다음 체 위로 잎을 수확하면서 액체를 버립니다. 플라스틱 비커에 1L의 물을 넣어 잎을 두 번 세척한 후, 페이퍼 타월로 잎을 완전히 건조시키고 새 플라스틱 튜브에 잎을 모아 액체 질소로 급속 냉동합니다. 염색질 분리 단계 전까지 샘플을 -80°C에서 보관하십시오.</p><p>액체 질소로 냉각된 막자사발을 사용하여 냉동된 시료를 고운 가루가 될 때까지 갑니다. 분말을 50 milliliter 플라스틱 튜브로 옮깁니다. 분말을 30 milliliters의 추출 버퍼 1번에 현탁시키고, 오버헤드 쉐이커에서 4 °C로 15분 동안 배양합니다.</p><p>현탁액을 4겹의 미러 클로스(mirror cloth)를 통해 새 50 milliliter 플라스틱 튜브에 거릅니다. 원심분리 후, 상층액을 제거합니다. 다음으로, 페인트 붓을 사용하여 펠릿을 50 microliters의 추출 버퍼 2번에 재현탁시킨 후, 추출 버퍼 950 microliters를 추가로 넣습니다.</p><p>둘째, 현탁액을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 10분 동안 원심분리합니다. 그동안 1.5 mL의 추출 버퍼가 담긴 2 mL 마이크로 원심분리 튜브를 준비합니다. 셋째.</p><p>다음으로, 상층액을 제거하고 300 microliters의 추출 버퍼에 펠렛을 서서히 현탁시킵니다. 세 번째 단계입니다. 먼저, 소량의 버퍼를 첨가합니다.</p><p>세 번째로, 붓을 사용하여 펠렛을 현탁시킨 후 남은 버퍼를 추가합니다. 이제 준비된 1.5 milliliters의 추출 버퍼가 든 튜브 위에 샘플을 조심스럽게 층을 이루어 올립니다. 세 번째 단계로, 두 층이 섞이지 않도록 주의하며 4 °C에서 16,000 ×g로 1시간 동안 샘플을 원심분리합니다.</p><p>상청액을 버리고, 300 µL의 sonication buffer를 사용해 페인트 브러시로 chromatin 펠릿을 현탁시킨 후, DNA 크기가 약 400 bp가 되도록 chromatin을 초음파 처리합니다. 초음파 처리 시 chromatin의 온도가 약 30 °C 이상으로 올라가지 않도록 주의하십시오. 열에 민감한 cross-link를 보호하기 위해, 초음파 처리한 샘플을 원심분리하여 용해되지 않은 물질을 침전시키고, 상청액을 protein agarose와 antibody binding buffer가 들어 있는 2 mL 마이크로 튜브로 회수합니다.</p><p>준비된 샘플 크로마틴 200 µL를 첨가합니다. 오버헤드 쉐이커에서 1시간 동안 튜브를 배양합니다. 원심분리 후 샘플 상층액을 수집하고 단백질 30 µL를 분주합니다.</p><p>입력 물질의 크로마틴 농도를 측정하기 위해 새로운 1.5 mL 튜브에 분취합니다. 초음파 처리된 크로마틴 40 µL를 남겨둡니다. 그런 다음, 단백질 A-beads 30 µL와 적정량의 변형 특이적 항체가 포함된 용액에 초음파 처리된 크로마틴 현탁액 400 µL를 첨가하고 4 °C의 오버헤드 셰이커에서 하룻밤 동안 배양합니다.</p><p>440 ×g에서 2분 동안 원심분리하여 비드를 회수합니다. 상층액을 제거하고, 오버헤드 쉐이커에서 각 버퍼 900 µL를 사용하여 비드 펠릿을 10분씩 연속으로 세척합니다. 마지막 세척 후, 남아 있는 버퍼를 완전히 제거합니다. 히스톤에서 DNA를 분리하기 위해, 비드에 D cross linking buffer 400 µL와 앞서 보존해 둔 40 µL의 입력 시료를 추가하고 5분 동안 볼텍싱한 후, 시료를 원심분리하고 65 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.</p><p>이제 상용 DNA 정제 키트로 DNA를 정제하고 일반적인 로커스 특이적 실시간 정량 R-T-P-C-R을 수행합니다. 본 예시에서는 Arabidopsis ANA PR 2 방어 유전자의 발현이 식물 호르몬인 살리실산의 합성 유사체인 Benzo Diaz ole에 의해 유도되었습니다. 결과는 PR 2 발현의 활성화가 PR 2 프로모터 상의 히스톤 H3 및 H4의 리신 잔기 아세틸화 증가와 연관되어 있음을 보여줍니다.</p><p>이 절차를 수행할 때, 잎 가루에 추출 버퍼 1을 추가하면 밀폐된 fcon 튜브 내에 과압이 발생한다는 점에 유의해야 합니다. 주기적으로 튜브를 열어 공기를 빼주십시오. 또한, 다음 버퍼를 추가하기 전 펠렛을 현탁시킨 후 붓을 제거하지 않도록 주의하십시오.</p><p>이 영상을 시청한 후, 여러분은 포름알데히드 기반의 DNA 및 히스톤 교차 결합, 크로마틴 면역침강 분리, 그리고 로커스 특이적 DNA 정량을 통해 히스톤 수식 및 평면 레버를 결정하는 방법을 충분히 이해하게 될 것이며, 이를 통해 식물 생물학의 다양한 분야에서 크로마틴과 그 수식의 역할에 관한 핵심 질문들에 답할 수 있을 것입니다.</p>

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 여기에서 식물 단백질 복합체의 정제 및 특성에 대한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 단지 내에 하나의 단백질을 immunoprecipitating에 의해, 그래서 우리는 그것의 번역 후 변형과 상호 작용하는 파트너를 식별 할 수있는 것을 보여줍니다.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

우리는 면역 염색, 형광 제자리 교잡, 전체 마운트 애기 장대 난자의 양적, 고해상도 이미징 다음 DNA 염색 여기를 효율적이고 신뢰할 수있는 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 성공적 염색질 변형 및 핵 구조를 분석하는데 사용 하였다.

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법<em&gt; 애기 장대</em

염색질 면역 침전은 DNA가 생체 내에서 애기 단백질의 결합 부위의 식별을위한 강력한 기술이다. 이 절차는 염색질 가교과 분열, 관심의 단백질에 선택적 항체와 면역과 결합 된 DNA의 qPCR에 분석을 포함한다. 우리는 애기 장대 식물에 최적화 된 간단한 칩 분석에 대해 설명합니다.

애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석<em&gt; 생체</em

이 프로토콜은 질량 분석기 (MS)를 사용하여 히스톤 번역 후 변형을 특성화하기위한 완벽하게 통합 된 워크 플로우를 설명합니다. 워크 플로는 나노 흐름 액체 크로마토 그래피 및 데이터 분석을위한 지침을 사용하여 세포 배양 또는 조직, 히스톤 유도체 및 소화, MS 분석에서 히스톤 정화를 포함한다. 삼일 -이 프로토콜은 2 내에 완성을 위해 설계되었습니다.

히스톤 추출에서 데이터 분석에 : 상향식 질량 분석 사용 히스톤 번역 후 변형 분석을위한 완벽한 워크 플로우

이 프로토콜은 엔지니어링 가뭄 내성 작물을 돕기 위해 잠재적 후성 유전학 마커역할을 할 수 있는 번역 후 변형 후 프로파일링을 위해 사탕수잎 재료로부터 손상되지 않은 히스톤을 효과적으로 추출하기 위해 개발되었습니다.

잠재적 인 후성 유전학 마커의 하향 식 질량 분광프로파일링을위한 수줌 잎 조직에서 히스톤의 격리

여기서, 우리는 M. oryzae 및 그밖 필라멘트 균류의 병기에서 새로운 표적 유전자를 확인할 수 있는 히스톤 수정의 게놈 전체 분포를 분석하기 위하여 프로토콜을 제시합니다.

<em>마그나포테 오리자에서</em> 크로마틴 면역 침전 시퀀싱 방법을 이용한 히스톤 수정 분포의 게놈 전체 분석

표적 및 태멘테이션 (CUT&amp;Tag) 하에서의 절단은 효율적인 크로마틴 에피게놈 프로파일링 전략이다. 이 프로토콜은 식물에서 히스톤 수정의 프로파일 링을위한 세련된 CUT &amp; Tag 전략을 제시합니다.

표적 및 태비네이션 하에서 절단을 사용하는 식물에서의 H3K4me3 수정 프로파일링

이 프로토콜은 입체 세포 배양 시스템이 거의 생리적 인 상태에서 염색질 변형을 모델링, 치료 및 분석하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 설명합니다.

간 조직의 3D 세포 배양 모델에서 히스톤 번역 후 변형의 글로벌 수준 정량화

형광 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 감지하기 위한 이미징 기술입니다. 여기에서는 식물 조직에서 유전자 발현의 후성유전학적 조절을 위해 히스톤 변형 효소와 전사 인자를 모집하는 전사 인자의 연관성을 연구하기 위해 FRET 프로토콜이 제시됩니다.

형광 공명 에너지 전달에 의한 <em>생체 내</em> 히스톤 변형 효소와 전사 인자 간의 상호 작용 조사

액체 크로마토그래피, 포획 이온 이동도 분광법 및 비행 시간 질량 분석법(LC-TIMS-ToF MS/MS)을 기반으로 하는 분석 워크플로우는 주요 매개변수(머무름 시간[RT], 충돌 단면[CCS] 및 정확한 질량 대 전하[m/z] 비율)를 기반으로 히스톤 변형 및 식별에 대한 높은 신뢰도와 재현성 있는 "상향식" 분석을 제공합니다.

액체 크로마토그래피, Trapped Ion Mobility Spectrometry 및 Time-Of-Flight Mass Spectrometry를 사용한 Histone Modification Screening

이 프로토콜은 동일 시료 내에서 식물 이온 누출, 과산화효소 활성, 칼로스 생성을 평가하는 고처리량 접근법을 설명합니다.

고처리량 형식을 이용한 미생물 2차 대사산물에 대한 잎 반응 평가

배우세요 식물 유전자에서 히스톤 수정을 검출하는 크로마틴 면역침전법을 Arabidopsis를 이용하여. 이 방법은 광합성과 면역 반응 관련 유전자 발현 조절 메커니즘 연구에 활용됩니다.

식물 잎에서 히스톤 수정을 감지

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