의 DNA 지문 Mycobacterium 레인스

본 절차의 전반적인 목표는 나병을 유발하는 배양 불가능한 박테리아인 mycobacterium leprae의 구별 가능한 DNA 지문을 임상 검체로부터 직접 개발하는 것입니다. 환자 생검 조직에서 추출한 M. leprae 박테리아 DNA를 가변수 탠덤 반복(variable number tandem repeat) 또는 VNTR 유전자 좌위(loci)에 특이적인 형광 프라이머를 사용하는 멀티플렉스 PCR로 증폭합니다. DNA가 증폭되면, 단편 길이 분석을 위해 모세관 전기영동을 수행합니다.

각 유전자좌(locus)에 존재하는 짧은 반복 서열(short tandem repeat) DNA 분절의 수를 결정하기 위해 데이터를 분석합니다. EPRI의 서로 다른 균주들은 각 유전자좌에서 서로 다른 수의 반복 서열을 나타내기 때문입니다. 여러 유전자좌의 데이터를 통해 고유한 DNA 지문을 생성할 수 있으며, 이 기술을 사용하여 환자의 균주 유형에 대한 데이터베이스를 구축할 수 있습니다.

특정 지역사회 및 전 세계 환자들 사이의 나병 집단 구조, 진화 및 전파 특성을 규명함으로써, 궁극적으로 나병 퇴치를 위한 유전적 도구와 증거를 제공할 수 있습니다. 이 방법은 나병의 확산을 추적하고, 최근 감염 클러스터와 고위험군 개체를 식별하며, 관리 프로그램의 효능을 측정하는 데 사용될 수 있습니다. 실험 절차는 본 연구실의 연구원인 Lee와 Ron Jensen, 그리고 기기 코어 시설의 Jason Rivers가 시연할 것입니다. 표준 KaiGen DNA 추출 키트를 사용하여 임상 생검 조직에서 DNA를 추출하십시오.

DNA를 확보한 후, 깨끗한 PCR 캐비닛 내부에 새로운 작업 공간을 설정합니다. DNA 오염을 방지하기 위해 캐비닛과 피펫 세트를 70% ethanol로 닦아내고, 캐비닛과 피펫에 15분 동안 UV light를 조사합니다. 캐비닛이 세척되면 멀티플렉스 PCR을 설정할 수 있으며, 각 멀티플렉스 PCR에는 한 쌍당 하나의 프라이머가 형광 표지된 4~5쌍의 프라이머 쌍이 사용됩니다.

혼합해야 합니다. TE 버퍼로 준비된 10 µM 프라이머 스톡을 사용하여 프라이머 믹스를 만듭니다. 모든 정방향 또는 상단 프라이머를 하나의 튜브에 동일한 양으로 혼합하여 최종 농도가 2 µM이 되도록 합니다. 각 프라이머에 대해 필요한 경우 TE 버퍼를 추가하십시오.

다른 튜브에 모든 역방향 또는 하단 프라이머를 동일한 방식으로 혼합합니다. 프라이머 혼합물이 준비되면 PCR MES 믹스를 조제합니다. 샘플당 모든 샘플과 대조군이 표시된 플레이트 맵을 작성합니다.

마스터 믹스는 12 µL의 KaiGen multiplex PCR mix, 각 프라이머 풀 2 µL, 그리고 Q solution 2 µL를 포함해야 합니다. 대조군을 포함하고 피펫팅 손실분까지 고려하여 충분한 양의 마스터 믹스를 조제하십시오. 마스터 믹스를 짧게 원심 분리합니다.

다음으로 PCR 플레이트의 각 웰에 마스터 믹스 18 µL씩을 분주합니다. DNA 샘플의 오염을 방지하기 위해 장갑을 교체하고, 별도의 생물안전작업대(biosafety cabinet)를 닦아 소독합니다. 이전과 마찬가지로 후드의 오염 제거가 완료되면 플레이트를 해당 후드로 옮깁니다.

그런 다음 마스터 믹스가 포함된 각 웰에 2 µL의 DNA 샘플을 첨가합니다. 교차 오염을 방지하기 위해 반드시 에어로졸 방지 피펫 팁을 사용하십시오. PCR 플레이트를 조심스럽게 밀봉하고 짧게 원심 분리하여 내용물을 혼합합니다.

그런 다음 반응 플레이트를 써모사이클러에 넣고 시료 제출을 위한 PCR 프로그램을 시작합니다. FLA의 경우, 깨끗한 에펜도르프 튜브에 폼아미드 사이즈, 마스터 믹스를 준비하고 희석된 PCR 산물을 첨가하여, 테스트할 시료당 high dfor amide 용액 12 µL와 gene scan, 500 lid sizing standard 0.3 µL를 혼합합니다. 이 용액 12.3 µL를 96웰 광학 품질 반응 플레이트의 각 웰에 분주합니다.

PCR이 완료되면 플레이트를 원심분리합니다. 각 샘플의 위치가 플레이트 맵에 기록되었는지 확인하십시오. 그런 다음 별도의 96웰 플레이트의 각 웰에 nuclease free water 59 µL씩 분주하고, 각 PCR 반응액 1 µL를 추가하여 증폭된 DNA를 1:60으로 희석합니다.

DNA 희석이 완료되면, 멀티 채널 피펫을 사용하여 희석된 각 PCR 샘플 1 µL를 formamide 루즈 용액이 들어 있는 플레이트의 해당 웰에 옮깁니다. 프로그램이 완료되면, 표준 아가로스 겔 전기영동으로 샘플을 테스트하여 예상 크기의 DNA 단편이 증폭되었는지 확인할 수 있습니다. 샘플은 FLA 유전자 분석기를 이용한 형광 모세관 전기영동 분석을 위해 준비됩니다. 분석 전, 플레이트에 셉텀을 씌우고 짧게 원심분리하여 기포를 제거하고 샘플이 웰 바닥에 밀착되도록 합니다.

IDE는 가닥을 화학적으로 변성시키므로 열 변성 과정이 필요하지 않습니다. 플레이트를 로딩 트레이에 놓으십시오. ABBI'S genetic analyzer 31 30 xl와 같은 모세관 전기영동 장치를 사용하여 표지된 PCR 산물을 분석하십시오.

분리 매질로 POP-7 폴리머가 채워진 50 centimeter 모세관을 사용하여 샘플을 분석합니다. DNA는 모세관 끝단으로 이동하며, 그곳에서 레이저와 검출기가 형광 표지를 측정합니다. 분석기의 수집 소프트웨어를 엽니다. 샘플을 실행하기 전, 크기 표준물을 포함하여 사용된 모든 염료를 검출할 수 있도록 분석기를 교정해야 합니다. 이 샘플들에 사용된 dset은 ABI의 G5입니다. 샘플은 1.6 kilovolts에서 15초 동안 전기동역학적으로 주입됩니다.

15 kilovolts를 1800초 동안 인가하여 단편들을 분리합니다. 각 런의 총 소요 시간은 약 45분입니다. 런이 완료되면 각 샘플에 대한 데이터 파일을 생성합니다.

분석기의 수집 소프트웨어가 파일을 미리 지정된 위치의 플레이트 폴더에 저장합니다. 파일은 FSA 형식입니다. FLA 데이터는 Applied Biosystems 웹사이트에서 무료로 제공되는 peak scanner 소프트웨어를 사용하여 분석할 수 있습니다.

데이터를 분석하려면 'start new project'를 클릭한 다음 'add files'를 클릭하십시오. 양성 및 음성 대조군을 포함하여 선택한 데이터 파일을 프로그램으로 로드하십시오. 로드된 파일을 선택하여 분석하십시오.

결과는 FLA 크로마토그램으로 도식화됩니다. 크기 표준물질은 주황색 피크로 나타나며, 유색 피크는 샘플에서 분석된 각 로커스(locus)에 대한 박테리아 DNA 분석물을 나타냅니다. 피크를 클릭하면 염기쌍 크기를 확인할 수 있습니다. DNA 중합효소의 슬립 스트랜드 합성(slip strand synthesis)으로 인해, 일부 마이크로새틀라이트 로커스에서는 동일한 색상의 피크 군이 검출될 수 있습니다.

이러한 경우, 일반적으로 진폭이 가장 큰 피크를 선택합니다. 각 샘플의 단편 크기를 양성 대조군 크기와 비교하여 테스트한 각 대립유전자에 대해 탠덤 반복 세그먼트가 몇 개 존재하는지 결정하고, 추가 분석을 위해 데이터를 Excel 스프레드시트에 기록하십시오. 이 그림에서는 동일한 마을 출신의 서로 다른 세 가족에 속한 환자 7명으로부터 분리한 균주의 DNA 지문이 표시되어 있으며, 분석된 각 다형성 유전자좌의 탠덤 반복 횟수가 나타나 있습니다.

이 데이터는 B 가족의 구성원 두 명은 동일한 균주에 감염된 반면, 한 명은 다른 균주에 감염되었음을 시사합니다. C 가족의 구성원들은 동일한 균주에 감염되었을 가능성이 높습니다. A 가족의 구성원들 또한 마찬가지입니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 클리닉에 내원한 한센병 환자의 V-N-T-R-D-N-A 지문을 얻기 위해 멀티플렉스 PCR 및 단편 길이 분석을 일상적으로 포함하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이는 나병 질환 관리를 위한 기존의 역학 조사를 보완하는 새로운 분자 도구들입니다.