Name: 두개골 방사선 치료에 의한인지 기능 장애의 회복을위한 세포 이식 전략을 줄기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 배우세요 두개골 방사선 치료 후 인지 기능 장애 회복을 위한 줄기세포 이식 방법을 무흉마우스에 적용하는 과정입니다. 이 기법은 뇌종양 환자의 신경 발생 억제를 완화하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 지원 정돈하기 위해 NIH NINDS 부여 R01 NS074388 581 (CL Limoli), 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM) 부여 RS1 - 00413 (CLL), CIRM 교육 그랜트 TG2 - 0115 (MMA) 및 CIRM 그랜트에 의해 지원되었다 비디오 설명서.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

상당한 연구가 진행 줄기 세포가 손상된 세 병에 걸린 조직 8 정상 기능을 복원하는 임상 사용할 수있는 방법의 무수한를 탐험합니다. 이러한 노력의 궁극적인 실현은 손상 정상 조직에서 구분되는 독특한 microenvironments 이내 engrafted 세포의 동작에 대한 자세한 이해가 필요합니다. 우리 작품은 조사 조직 침대 이내 cranially engrafted NSCs이 기능들은, 생존 마이 그 레이션 및 신경 및 glial lineages이 따라 차별 인식을 복원할 수 보여주었다. 정확히 어떻게 이러한 전지는 현재 불확실 인식의 회복을 중재하지만 재현할 방식으로 신중하게 통제 실험 절차의 일련의 실시에 따라 않습니다. 우리는과 관련된 불리한인지 효과를 ameliorating을위한 줄기 세포 요법의 translational 잠재력을 신속하게하기 위해 노력 이곳이 중요한 절차를 상세도두뇌와 암 다른 형태의 임상 관리. 데이터의 품질 상당한 영향을 미칠 가능성이 추가적인 고려 사항은 다음과 강조 표시됩니다. 이식 기반 요법은 중요한 시약으로 줄기 세포에 의존하고, 따라서 치료가 제대로, 문화를 특징 짓는 불임을 유지하고 결과의 신뢰성에 대해 일치하는 통로 번호를 사용하여 행사해야합니다. 이식 인간의 줄기 세포가 생체내에서 그들을 추적 하나의 수단을 제공하기 위해, 이전에 수술 BrdU으로 표시되었습니다. 우리의 실험 조건에서 이식 NSCs는 BrdU 라벨의 희석이 문제가 아니하므로, 광범위한 확산을 받아야하지 않았다. 또한, 이식된 인간의 줄기 세포는 이러한 핵 매트릭스 단백질 (H - NUC 또는 hNUMA) 9 또는 인간의 특정 핵 항원 (HuNu) 2과 같은 인간의 특정 마커에 대한 immunostaining하여 호스트 세포를 구분할 수 있습니다. 인간 줄기 세포도 함께 표시 수형광 마커의 다양한 호스트 뇌 내에서 식별을 용이하게합니다. 방사선 매개 변수에주의 정확한 선량 전달 기술을 정의하고 그 현재 방사선 종양학의 모델을 현재의 임상 사례를 설명했다. 두뇌에있는 줄기 세포의 이식 재현성도 중요하고, 디지털 stereotaxic 악기를 사용하여 수행됩니다. 정확하게 해마 같은 작은 뇌 구조에 줄기 세포 주입을위한 마이크로 주사기를 micromanipulate하는 기능을 크게 인간의 오류를 줄여줍니다. 이 장치로, NSCs은 쥐 해마의 후부 지역에 앞쪽에을 걸치는 뚜렷한 사이트에 이식했다. Dorso - 복부 (DV) 좌표는 수술 절차 hippocampal 형성 2 손상을하지 않겠다는 등 athymic 누드 (ATN) 쥐와 경험을 바탕으로 결정됩니다. 쥐의 두뇌를 통해 코로나 섹션은 hippocampal 형성 포함의 주요 구조를 보여이가있는 이랑 (DG), 이가있는 hilus (DH)와 CA1과 CA3 subfields (그림 8) uding. 보이는 바늘 넓이 (NT, 떨어지면)에서 dorsally 소개 이식 NSCs은, 어둡게 (갈색) 세포가 이후 septo에 걸쳐 마이 그 레이션 단지 코퍼스의 callosum 아래의 이식 릴리스 사이트 (TR) (CC)에서 입금 얼룩으로 시각 아르 해마의 - 시간적는 축.

<table border="1"><tbody><tr><td> 재료 이름 </td><td> 유형 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> 디지털 Stereotaxic 악기 w/45 °와 18 ° Earbars </td><td> 두개골 이식 외과 설치 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 (이전 : MyNeuroLab) </td><td> 39463501 </td><td> 유용한 액세서리 : 히터 및 가변 전류 소스와 함께 무대 (수술하는 동안 체온을 유지하기 위해) </td></tr></tbody></table>

두개골 방사선 치료에 의한인지 기능 장애의 회복을위한 세포 이식 전략을 줄기

Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

방사선은 종종 기본 또는 전이성 뇌종양 시달리다들을 위해 유일하게 임상 수단을 제공합니다. 유익한 동안, 두개골 방사선이 부분에서 신경 줄기 세포의 고갈로 인해 발생할 수 있습니다 인식에서 진취적이고 쇠약 거부할을 일으킬 수 있습니다. 인지 건강의 관점에서 뇌 암, 삶의 질 진단 환자의 증가 생존을 감안할 때, 특히 어떤 만족스러운 장기 치료의 부재에서 증가 우려되고있다. 우리가 방사선 - 유발인지 하락에 대처하기 위해 전략으로 줄기 세포 교체를 사용한이 심각한 건강 문제가 해결합니다. 우리의 모델은 두개골 방사선의 대상이 athymic 누드 쥐를 활용합니다. 이온화 방사선이 중 전체 뇌 또는 린 귀에 ccelerator (LINAC) radiosurgery 기반 stereotaxic 통해 해마에 매우 집중 광선으로 제공됩니다. 조사 다음 두 가지 일, 후인간 신경 줄기 세포 (hNSCs)은 stereotaxically 해마에 이식되었다. 쥐 그때인지, 이식할 세포 생존의 변화와 조사 후 분화 특정 마커 1과 4 개월의 표현에 대해 평가했다. 우리인지 테스트 패러다임이 hNSCs와 engrafted 동물인지 기능에 상당한 개선을 전시 것을 증명하고있다. 불편 stereology은 이식할 세포의 양과 종류에 따라 이식 후 engrafted 1 셀 및 4 개월의 중요한 생존 (10~40%)를 보여줍니다. Engrafted 세포가 광범위하게 마이 그 레이션, glial와의 연결 lineages 따라 차별하고, 미숙하고 성숙한 phenotypic 마커의 범위를 표현한다. 우리의 데이터는이 절차 언젠가 두개골 radiot의 대상이 개인의인지의 장기적인 기능 회복을위한 유망한 전략을 감당할 수있는 제안, engrafted 인간의 줄기 세포에서 파생된 직접인지 이점을 입증herapy. 우리의 연구를 복제하고 확장하는 데 필요한 중요한 절차의 보급을 촉진하기 위해, 우리는 stereotaxic radiosurgey 및 이식에 대한 강조와 함께, 우리의 실험 계획의 몇 가지 주요 단계 서면 및 비주얼 문서를 제공합니다.

뇌종양 환자는 정기적으로 두개골 방사선 치료를 받아야하고, 쇠약인지 장애에 도움이 치료는 종종 결과를하면서. 이 심각한 해결되지 않은 문제는, 현재도 임상을 일으키하지 않으며 방사선 유발인지 감소의 복구를 위해 줄기 세포 기반 요법을 고안하기 위해 노력을 주도하고 있습니다.

방사선 치료는 일차성 또는 전이성 뇌종양 환자들에게 종종 유일한 임상적 해결책이 됩니다. 두개골 조사(cranial irradiation)는 유익하지만...

다음 실험의 전반적인 목표는 줄기세포를 해마에 재현성 있게 이식하는 것입니다. 먼저, 뇌암의 임상 관리 과정에서 발생할 수 있는 상황을 모의하여 무흉선 쥐에게 정위 방사선 치료를 실시합니다. 실험실에서는 이식을 위해 인간 신경 줄기세포를 배양하며, 일반적으로 쥐 한 마리를 치료하는 데 1 million cells가 필요합니다.조사 후 2일이 지나면, 줄기세포를 해마의 정확한 위치에 천천히 주입합니다. 최종적으로, 이 프로토콜은 이식된 줄기세포가 해마 전체로 이동하는 과정을 보여줍니다. 저는 두개골 조사 후 신경발생 억제를 되돌리기 위해 줄기세포를 사용하는 방안을 고민하면서 이 방법론들을 처음 구상하게 되었습니다. 일반적으로 이 방법을 사용하는 연구자들은 줄기세포의 성장이 쉽지 않으며 항생제 없는 배양 조건 하에서 매일 세심한 주의와 관리가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.본 절차의 시각적 시연을 통해 작고 명확하게 정의된 뇌 부위를 정밀하게 조사하기 위해 사용되는 영상 재구성의 임상 과정을 명확히 알 수 있을 것입니다. 조사 절차의 시연은 본 학과 임상 교수인 Dr.Dante Rowa가 맡을 예정입니다. 줄기세포 준비 과정은 본 실험실의 기술자인 Ms.Mary Land와 Catherine Tran이 시연하며, 박사후 연구원인 Dr.Muja가 이식에 필요한 절차를 시연할 것입니다.치료 전 정확한 동물 위치 선정을 위해 영상 유도 방사선 치료 소프트웨어를 사용하며, 뇌의 다른 부위에 대한 방사선 손상을 최소화하면서 표적 조사를 수행하기 위해 변조 방사선 치료를 이용합니다. MRI 스캔 24시간 후, 진정된 동물을 방사선 종양학 CT 스캐너에 배치하여 또 다른 단면 영상 볼륨을 생성합니다. 쥐를 MRI 스캔 시와 동일한 위치에 두고, CT 장비가 두개골 영역을 스캔하도록 설정하여 CT 치료 계획 데이터를 생성합니다.0.8 millimeter 두께의 CT 영상 106장을 획득합니다. 그다음, MRI 및 CT 영상 데이터를 Eclipse 치료 계획 소프트웨어로 전송합니다. Eclipse를 사용하여 골격 구조와 연부 조직 일치 여부에 따라 MRI와 CT 데이터를 융합합니다.이 단계에 소요되는 시간은 가변적이며, 이미지 품질에 따라 1시간에서 3시간 정도 걸릴 수 있습니다. 만족스러운 이미지 융합 결과가 얻어지면, 조사 대상 영역과 인접한 주요 장기의 윤곽을 설정하십시오. 조사는 뇌 전체에 수행하거나 개별 해마와 같은 특정 체적 영역으로 제한하여 수행할 수 있습니다.등고선(contour)은 이러한 장기들의 위치뿐만 아니라, 선량 분포를 최적화하는 데 필수적인 부피 정보까지 제공합니다. 선량 분포를 최적화하려면, eclipse의 선량 최적화 창에 목표 선량, 목표 적합도 및 중요 장기에 대한 선량 제한 정보를 입력하십시오.계획이 생성되면, eclipse는 계산된 선량을 축상면, 관상면, 시상면 영상에 중첩하여 제공하며, 선량-부피 히스토그램 형식으로도 제공합니다. 이 시점에서 해당 계획이 조사에 적합한지 또는 개선이 필요한지 판단하기 위해 계획을 평가해야 합니다. 조사 과정을 시작하려면, 진정된 쥐를 종이 담요로 덮어 체온을 유지하도록 합니다.몇 분 후, 담요로 덮여 있되 두개골은 노출된 상태의 쥐를 방사선 치료용 선형 가속기의 치료 테이블 위에 놓습니다. CT 스캔 생성 시 사용했던 것과 동일한 위치에 배치해야 합니다. 이 단계는 선량 전달의 정확성을 보장하는 데 매우 중요합니다.다음으로, 방사선 치료용 선형 가속기의 내장 영상 시스템을 사용하여 진정된 쥐의 직교 엑스레이 영상을 획득합니다. 획득한 직교 엑스레이 영상을 Eclipse에서 제공하는 참조 영상 세트에 공동 등록(coregister)하고, 정확한 영상 정렬을 위해 필요한 위치 보정을 수행합니다. 단일 해마의 경우 6분할 조사면 IMRT 계획으로, 양측 해마의 경우 2개 아크 RapidArc 계획으로 10 Gy 선량을 조사합니다. 치료 조사가 완료되면 쥐를 치료실에서 꺼내어 가온 유지 케이지에서 회복하도록 합니다.수술 준비를 위해, 마취된 A TN rat의 머리 부분 털을 전기 이발기로 제거합니다. 층류 후드 내에서 포비돈 요오드와 70% ethanol을 반복적으로 사용하여 제모한 부위를 세척합니다. 정위 고정 장치, 마이크로 드릴, 건식 멸균기와 컨트롤러를 준비합니다.동물을 가열된 표면에 올려 수술 동안 체온을 유지하십시오. 수술 전과 수술 전 과정 동안 멸균 장갑을 착용하고 70% ethanol을 분무하여 소독합니다. 수술 도구는 전용 층류 후드(laminar flow hood) 내에서 관리합니다.무균 상태를 유지하기 위해, 머리 부분만 노출되도록 소형 수술용 드레이프로 동물을 덮습니다. 외이도에 이어바(ear bar)를 삽입하여 동물의 머리를 스테레오택틱 프레임(stereotaxic frame) 내에 단단히 고정합니다. 이어바의 팁을 외이도로 밀어 넣을 때 각별히 주의하십시오.쥐의 상악 절치에 절치 바(incisor bar)를 걸고, 바의 높이를 표준 기준점에 맞추어 조절합니다. 그런 다음 코 클램프(nose clamp)를 조입니다. 정위 고정 제로점(stereotaxic zero)을 맞추기 위해 측면 움직임을 최소화하여 귀 바(ear bars) 사이에 머리 위치를 중앙으로 맞춥니다.동물을 적절한 위치에 고정한 후, 건조를 방지하기 위해 윤활성 안연고를 도포합니다. 수술 중에 연고를 한 번 더 도포합니다. 멸균된 메스를 사용하여 두피를 따라 정중선에 2cm 길이의 피부 절개를 실시합니다.멸균 면봉을 사용하여 해당 부위를 세척합니다. 다음으로, 골막을 벌려 고정하기 위해 해부용 리트랙터를 삽입합니다. 출혈이 발생하면 해당 부위에 강한 압박을 가합니다.1% 과산화수소에 적신 면봉을 사용하여 두개골을 덮고 있는 연조직을 제거하여 봉합선인 bgma와 lambda가 보일 때까지 닦아냅니다. 정위 수술에서 가장 어려운 부분은 정위 고정틀 내에 동물의 머리를 정확하게 위치시키는 것입니다. 동물의 두개골에 정확한 정위 좌표를 표시하려면, 쥐 뇌 지도(wrap brain atlas)를 사용하여 정확한 정위 좌표를 결정하십시오. 본 연구에서는 bgma를 기준으로 하며, 다음의 정위 좌표를 사용하여 두개골의 위치를 표시한 후 네 곳의 서로 다른 지점에 줄기세포 이식을 수행합니다. 먼저, bgma를 확인하십시오.다음으로 영점을 잡습니다. 디지털 디스플레이 컨트롤러의 세 좌표를 모두 0으로 맞춥니다. 영점 조절이 완료되면, 미리 정해진 좌표를 사용하여 이식 부위의 위치를 찾고 프레임의 프로브 홀더에 부착된 세밀한 마커로 표시합니다.드릴을 사용하여 표시된 각 위치의 두개골에 0.35 millimeter 구멍을 뚫습니다. 경막이 손상되지 않도록 주의하십시오. 드릴링 중 출혈이 발생하면 면봉을 사용하여 강하게 압박하십시오.이제 동물을 이식할 준비가 되었습니다. 이식에 사용할 인간 신경 줄기세포는 미리 준비하여 필요할 때까지 얼음 위에 보관해야 합니다. 준비가 되면, 30 gauge Hamilton 마이크로 시린지에 세포 현탁액 5 µL를 채웁니다.충전된 시린지를 스테레오택식 프레임의 소형 프로브 홀더에 부착하십시오. 정확한 위치로 이동시킨 후, 바늘 끝을 두개골의 구멍에 조심스럽게 삽입하여 뇌 표면에 닿을 때까지 밀어 넣으십시오. 디지털 디스플레이 컨트롤러의 DV 좌표를 0으로 설정한 다음, 바늘을 원하는 깊이까지 천천히 삽입하십시오.바늘을 1분 동안 그대로 둡니다. 그 후, 분당 0.25 µL의 속도로 총 1 µL의 세포를 주입합니다. 주입 내용물이 바늘 경로를 통해 모세관 역류하는 것을 방지하기 위해 바늘을 8분 동안 유지한 다음, 분당 0.5 mm의 속도로 이식 부위에서 바늘을 천천히 제거합니다.남은 이식 부위에 대해서도 이 절차를 반복합니다. 주입이 완료되면 피부 견인기를 제거하고 뭉툭한 핀셋을 사용하여 피부를 두개골 위로 조심스럽게 당겨 덮습니다. 수술 후 4~5개의 멸균 스테인리스 클립을 사용하여 상처 부위를 폐쇄합니다.동물을 가온 케이지에 넣고 회복 상태를 모니터링합니다. 이식 한 달 후, 뇌 샘플을 절편화하고 BRDU로 염색하여 이식된 NSCS를 검출한 다음 헤마틴으로 대조 염색하였습니다. 빨간색 선으로 표시된 바늘 경로(needle track)는 그림과 같이 TR로 지정된 이식 방출 부위에 NSCS를 주입한 궤적을 나타냅니다.여기서 이식된 NSCS는 뇌량(corpus callosum)과 CA1 영역에서 해마의 치상회(dentate gyrus) 및 CA3 영역으로 광범위하게 이동하는 양상을 보였습니다. 획득한 MRI 영상 세트를 그에 대응하는 CT 영상 세트에 정확하게 정렬하여 사용하는 것이 중요합니다. 치료 절차 전 해마 영역을 식별하고 이후 윤곽을 설정하기 위해서는 적절한 영상 융합이 필수적이며, 동물이 정확하게 배치되었는지 확인하기 위해 직교 X선 영상을 획득하십시오. 이식의 성공을 보장하기 위해 항상 멸균된 수술 환경을 유지하십시오.Otax 좌표를 정확하게 표시하고, 주입 후에는 액체가 역류하는 것을 방지하기 위해 마이크로 시린지를 서서히 제거하십시오. 이 영상을 시청한 후에는 선택한 동물 모델을 사용하여 임상적으로 유의미한 방사선 절차를 수행하는 방법과 뇌의 특정 영역에 줄기세포를 외과적으로 이식하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Medicine

의학

신경 전구체 이식은 보호 및 / 또는 척수 상해 (SCI)과 모터 신경 장애, amyotrophic 패스 경화증 (ALS)에 분실 / 역기능 자궁 phrenic 모터 뉴런을 교체 유망 전략이다. 우리는 ALS와 SCI의 쥐 모델에서 자궁 경부 척수 복부 혼까지 셀 전송을위한 프로토콜을 제공합니다.

루게릭병과 외상 척수 상해에서 자궁암 복부 호른를 타겟팅하는 Intraspinal 세포 이식

뇌 종양의 radiotherapeutic 관리로 인한인지 장애에 부정적인 삶의 질을 영향 임상 처치하기 어려운 상태를 나타냅니다. 비판적으로 방사선 - 유발인지 감소를 ameliorating에 대한 잠재적인 개입을 평가하는 능력은 궁극적으로인지의 엄격한 양적 평가를 수행하는 기능에 따라 달라집니다.

두개골 방사선 치료에 의한인지 감소를 Quantifying

출처: Furmanski, O., et al. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료적 이식을 통한 마우스 뇌 손상의 제어된 피질 충격 모델. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오에서는 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포를 심부 피질의 회백질-백질 경계에 입위적으로 주입합니다. 이식된 세포는 조직에 통합되어 손상된 뇌의 기능 회복과 회로 복구를 촉진합니다.

외상성 뇌손상이 있는 마우스에 신경 세포 현탁액의 정위 이식

줄기 세포는 내재 된 종양 향성으로 인해 뇌종양 치료제로서 유망한 치료제입니다. 비 침습적 비강 내 줄기 세포 전달은 혈액 뇌 장벽을 우회하여 임상 번역의 가능성을 보여줍니다. 이 기사는 신경 교종 마우스 모델에서 비강 줄기 세포 전달의 기본 원리를 요약합니다.

마우스 모델에서 아교 모세포종에 치료 용 줄기 세포 비강 전달

종양을 추구 치료 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 침략 세포종에 대 한 치료로 서 약속을 보여줍니다. 최적의 이식 건설 기계에 종양 절제술 구멍으로 MSCs의 납품을 포함 한다. 여기, MSC 세포종의 치료를 공부 하기 전 임상 기술을 포함 하 여 제공 됩니다: 이미지 기반 종양 절제술; 주입 장비의 MSC 시드; 그리고 수술 후 치료 추적입니다.

세포종과 치료 줄기 세포 시드 장비의 Intracranial 주입의 이미지 기반 절제

여기, 선물이 orthotopic 인간의 기본 뇌 종양을 들고 immunodeficient 마우스에 준비 및 수용자 인간 림프 톨의 stereotaxic 관리에 대 한 프로토콜. 이 연구는 타당성과 세포 immunotherapies intrabrain 전달의 antitumor 효능에 대 한-의 증거-개념을 제공합니다.

정위 적 입양 전송 Orthotopic 인간 세포종 님 Xenografts Murine 모델에서 세포 독성 면역 세포의

이 프로토콜은 두개골 외상성 뇌 손상의 마우스 모델과 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 세포의 이식에 대한 방법론을 상해 부위내로 시연한다. 이 절차에서 결과의 행동 그리고 조직학 시험은 또한 간략하게 기술됩니다.

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우리는 마우스 뇌에서 루시페라아제-녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 이중 리포터 벡터로 형질도입된 인간 신경 전구 세포의 사다리꼴 이식을 기술한다. 이식 후, 루시퍼라아제 신호는 형광 현미경을 사용하여 뇌 절편에서 확인된 생체 내 생체 발광 및 GFP 발현 이식된 세포를 사용하여 반복적으로 측정된다.

Intracerebral 이식 및 마우스 뇌에서 인간 신경 전구 세포의 생체 내 생체 발광 추적

중추신경계(CNS) 종양은 소아 암 관련 사망의 주요 원인이며, 임상 시험에서 환자를 대상으로 하는 국소 면역 기반 요법이 점점 더 많이 테스트되고 있습니다. 이 프로토콜은 CNS 종양을 표적으로 하는 면역요법 주입의 전임상 평가를 위해 마우스에서 국소 캐뉼라 이식 방법을 설명합니다.

마우스에서 연속 국소 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 주입을 위한 두개내 캐뉼라 이식

이 연구는 뇌졸중 후 반공간 방치를 해결하기 위해 인지 자극과 결합된 새로운 경두개 직류 자극(tDCS) 프로토콜을 제시합니다. 파일럿 환자의 초기 데이터는 절차의 타당성을 보장하고 잠재적 효능을 제안하여 향후 병렬, 삼중 맹검, 통제 임상 시험을 위한 기반을 제공합니다.

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배우세요 두개골 방사선 치료 후 인지 기능 장애 회복을 위한 줄기세포 이식 방법을 무흉마우스에 적용하는 과정입니다. 이 기법은 뇌종양 환자의 신경 발생 억제를 완화하는 데 활용됩니다.

두개골 방사선 치료에 의한인지 기능 장애의 회복을위한 세포 이식 전략을 줄기

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