두개골 방사선 치료에 의한인지 기능 장애의 회복을위한 세포 이식 전략을 줄기

다음 실험의 전반적인 목표는 줄기세포를 해마에 재현성 있게 이식하는 것입니다. 첫째, 기분표식이 없는 쥐는 뇌종양의 임상적 관리 중에 발생할 수 있는 일을 시뮬레이션하는 정위 방사선 요법을 받습니다. 실험실에서는 이식을 위해 인간 신경 줄기 세포를 성장시키며, 일반적으로 쥐 한 마리를 치료하는 데 100만 개의 세포가 필요합니다.

방사선 조사 후 2일 후, 줄기세포를 정확한 위치에서 해마에 천천히 주입합니다. 궁극적으로 이 프로토콜은 이식된 줄기세포가 해마 전체로 이동하는 것을 보여줍니다. 신경 발생의 억제를 역전시키기 위해 줄기 세포를 사용하는 전망을 고려하기 시작했을 때 이러한 방법론에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다.두개골 방사선 조사 후, 일반적으로 줄기 세포의 성장은 사소한 것이 아니며 항생제가 없는 성장 조건에서 일상적인 주의와 보살핌이 필요하기 때문에 이 방법을 사용하는 개인은 어려움을 겪을 것입니다.

이 절차의 시각적 시연은 작고 잘 정의된 뇌 부피의 정확한 방사선 조사를 위한 이미지 재구성에 사용되는 임상 프로세스를 쉽게 이해할 수 있습니다. 방사선 조사 절차를 시연하는 것은 우리 학과의 임상 교수인 Dante Rowa 박사입니다. 줄기세포의 준비는 제 연구실의 Mary Land 씨와 Catherine Tran 씨가 시연할 예정이며, 박사후 연구원인 Dr. Muja가 이식에 필요한 절차를 시연할 것입니다.

치료 전 정확한 동물 위치 파악을 위해 영상 유도 방사선 치료 소프트웨어를 활용하고, 뇌의 다른 부분에 대한 방사선 손상을 최소화하면서 표적 방사선 조사를 위해 조절 방사선 요법을 사용합니다.MRI 스캔 후 24시간 후, 진정제를 투여한 동물을 방사선 종양학 CT 스캐너에 넣어 또 다른 단면 이미지 볼륨을 생성합니다. MRI 촬영에 사용한 것과 동일한 위치에 쥐를 놓고 두개골 부위를 스캔하도록 CT 유닛을 설정하여 CT 치료 계획 데이터를 생성합니다.

0.8mm 두께의 CT 이미지 106개를 획득할 수 있습니다. 다음으로, MRI 및 CT 이미지 데이터를 Eclipse 치료 계획 소프트웨어로 전송합니다. Eclipse를 사용하여 뼈 해부학 및 연조직 일치를 기반으로 MRI 및 CT 데이터를 융합합니다.

이 단계는 시간이 가변적이며 이미지 품질에 따라 이 프로세스는 1시간에서 3시간까지 걸릴 수 있습니다. 만족스러운 이미지 융합이 얻어지면 조사할 대상 영역과 인접한 중요 기관을 윤곽을 그립니다. 방사선 조사는 뇌 전체에 전달되거나 개별 하마 캄피와 같은 특정 체적 영역으로 제한될 수 있습니다.

윤곽은 이러한 장기의 위치뿐만 아니라 용량 분포를 조정하는 데 중요한 부피 정보를 제공합니다. 투여 량 분포를 조정합니다. 중요 장기에 대한 목표 용량, 목표 적합성 및 용량 제약에 대한 정보를 Eclipse의 용량 최적화 창에 입력합니다.

계획이 생성되면 Eclipse는 축 관상 및 시상 이미지에 중첩 된 계산 된 선량을 선량 부피 히스토그램 형식으로 제공합니다. 이 시점에서 계획이 납품에 적합한지 또는 개선이 필요한지 결정하기 위해 계획을 평가해야 합니다. 방사선 조사 과정을 시작하려면 진정된 쥐를 종이 담요 아래에 놓아 따뜻하게 유지합니다.

몇 분 후, 담요로 덮인 방사선 치료 선형 가속기의 치료 테이블에 쥐를 놓지만 두개골이 노출 된 상태로 놓습니다. CT 스캔을 생성하는 데 사용된 것과 동일한 위치에 놓아야 합니다. 이 단계는 투여 전달의 정확성을 보장하는 데 중요합니다.

다음으로, 방사선 요법 선형 가속기의 온보드 이미징 시스템을 사용하여 진정 된 쥐의 직교 X 선 이미지를 획득하고, 직교 X 선 이미지를 Eclipse에서 제공하는 참조 이미지 세트에 공동 등록하고, 적절한 이미지 정렬에 필요한 위치 보정을 적용합니다. 단일 해마에 대한 6개 필드 IMRT 계획과 두 개의 하마 캠프 조사에 대한 2개의 아크 빠른 아크 계획을 사용하여 10 등급 선량으로 방사선 조사를 제공합니다. 시술 전달이 완료된 후 시술실에서 랩을 제거하고 가열된 보관 케이지에서 회복되도록 합니다.

수술을 준비하기 위해 전기 이발기를 사용하여 마취된 TN 쥐의 머리에서 털을 제거합니다. 층류 후드 내에서 작동하는 포비돈 요오드와 70% 에탄올을 반복적으로 적용하여 면도한 부위를 청소합니다. 입체성 기기, 마이크로몰 드릴, 건식 침대 살균기 및 컨트롤러를 준비합니다.

수술 중에는 가열된 표면에 동물을 눕혀 따뜻하게 유지하십시오. 멸균 장갑은 수술 전과 수술 내내 착용하며 70% 에탄올을 분사합니다. 수술 장비는 전용 층류 후드에서 유지됩니다.

무균 상태를 유지하려면 머리만 노출되도록 작은 수술용 커튼으로 동물을 덮으십시오. 귀바를 외이도에 삽입하여 동물의 머리를 입정계 프레임 내에 단단히 위치시킵니다. 에어 바의 끝을 외이도에 밀어 넣을 때 각별히 주의하십시오.

쥐의 윗니를 걸고 막대 높이를 표준 기준점으로 조정하여 앞니 막대를 배치합니다. 그런 다음 코 클램프를 조입니다. 입체성 제로를 달성하기 위해 최소한의 측면 움직임으로 이어바 사이의 머리 위치를 중앙에 배치합니다.

동물이 제자리에 놓인 후에는 건조를 방지하기 위해 윤활 눈 연고를 바르십시오. 수술 중에 연고를 한 번 더 바르십시오. 멸균 메스를 사용하여 두피를 따라 2cm 길이의 정중선 피부를 절개합니다.

멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 해당 부위를 청소하십시오. 다음으로, 해부 견인기를 삽입하여 골막을 열린 상태로 유지합니다. 출혈이 발생하면 해당 부위에 강한 압력을 가하십시오.

1% 과산화수소를 적신 면봉 어플리케이터를 사용하여 봉합사 bgma와 lambda가 보일 때까지 두개골을 덮고 있는 연조직을 제거합니다. 정위 수술의 가장 어려운 점은 정위 안경테에서 동물 머리를 정확하게 배치하는 것입니다. 동물 두개골의 정확한 입체 좌표를 표시하기 위해 랩 브레인 아틀라스를 사용하여 B bgma를 참조로 정확한 입체 좌표를 결정하십시오.이 연구에서는 줄기 세포 이식이 두개골의 위치를 표시하기 위해 다음 입체 좌표를 사용하여 4 개의 별개의 위치에서 수행됩니다.

다음 0. 디지털 디스플레이 컨트롤러의 세 좌표 모두. 영점 조정이 완료되면 미리 결정된 좌표를 사용하여 이식 부위를 찾고 프레임의 프로브 홀더에 부착된 미세한 점 마커로 표시합니다.

드릴을 사용하여 표시된 각 위치에서 두개골을 통해 0.35mm 구멍을 만듭니다. Durham 멤브레인이 손상되지 않도록 주의하십시오. 드릴링 중 출혈이 발생하면 면봉 애플리케이터를 사용하여 강한 압력을 가하십시오.

이제 동물을 이식할 준비가 되었습니다. 이식에 사용되는 인간 신경 줄기 세포는 미리 준비해야 하며 필요할 때까지 얼음 위에 보관해야 합니다. 준비가 되면 5마이크로리터 30게이지 Hamilton 마이크로 주사기에 셀 현탁액을 채웁니다.

채워진 주사기를 입체성 프레임의 작은 프로브 홀더에 부착합니다. 일단 올바른 위치로 옮겼다면, 바늘 끝을 두개골의 구멍에 조심스럽게 삽입하여 뇌 표면에 닿게 한다. 디지털 디스플레이 컨트롤러에서 DV 좌표를 영점 조정한 다음 바늘을 원하는 깊이까지 부드럽게 삽입합니다.

바늘을 1분 동안 제자리에 두십시오. 이 시간이 지나면 분당 0.25마이크로리터의 속도로 세포를 주입하여 총 1마이크로리터를 주입합니다. 모세혈관 역류를 방지하기 위해 주사 내용물이 바늘 트랙을 통해 역류하는 것을 방지하기 위해 바늘을 8분 동안 제자리에 유지하고 분당 0.5mm의 속도로 이식 부위에서 바늘을 천천히 집어넣습니다.

나머지 이식 부위에 대해 이 절차를 반복합니다. 주사가 완료되면 피부 견인기를 제거하고 뭉툭한 핀셋을 사용하여 피부를 두개골 위로 부드럽게 당깁니다. 수술 후 4-5개의 멸균 스테인리스 클립을 적용하여 상처를 봉합합니다.

동물을 가열된 우리에 넣고 회복을 모니터링합니다. 이식 1개월 후, 뇌 샘플을 절편하고 BRDU로 염색하여 이식된 NSCS를 검출하고 헤마틴으로 염색을 방지했습니다. 여기서 빨간색 선으로 표시된 바늘 자국은 보이는 바와 같이 TR로 지정된 이식 방출 부위에 NSCS를 침착한 주입 궤적을 나타냅니다.

여기서, 이식된 NSCS는 말뭉치(corpus cossum)와 캘리포니아 1 영역(CA one region)에서 해마의 덴테 이랑(dente gyrus)과 ca 3 영역으로의 광범위한 이동을 보여주었다. 획득 Mr.I 이미지 세트가 해당 CT 이미지 세트에 정확하게 사용되는 것이 중요합니다. 적절한 이미지 융합은 치료 절차 전에 해마 영역의 식별 및 후속 윤곽을 위해 중요하며, 동물이 정확한 위치를 잡았는지 확인하기 위해 획득 또는 직교 X-ray 이미지를 획득하여 이식의 성공을 보장하기 위해 항상 무균 수술 환경을 유지합니다.

Mark Otax는 정밀하게 조정하고 주입 후 마이크로 주사기를 서서히 제거하여 체액 역류를 방지합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 선택한 동물 모델을 사용하여 임상적으로 관련된 방사선 시술을 수행하는 방법과 뇌의 정확한 부위에 줄기세포를 외과적으로 이식하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.