Microfabricated 포스트 - 배열 감지기 (mPADs) : 기계적 힘을 분리하는 접근

안녕하세요, 저는 Nathan Snia Decky이며, 오늘 이 자리에는 Wes Ligan, Robbie Desai, Mike Yang이 함께하고 있습니다. 저희는 펜실베이니아 대학교의 Chris Chen 교수님 연구실 소속입니다. 본 영상에서는 미세 가공된 포스트 어레이를 사용하여 세포 간 인력(cellular attraction forces)을 측정하는 방법을 제시하겠습니다.

견인력은 미오신과 액틴의 상호작용을 통해 생성되며 우리 생체 내에서 중요한 역할을 합니다. 발달 과정에서 견인력은 세포가 조직의 초기 구조를 형성하기 위해 한 위치에서 다른 위치로 이동할 수 있게 합니다. 또한, 견인력은 상처의 폐쇄나 체내 백혈구의 이동 및 크롤링에 필수적이기 때문에 치유 과정에도 도움을 줍니다.

하지만 불행히도 이러한 동일한 힘들은 암 전이나 종양을 향한 혈관 성장과 같은 경우에는 건강에 해로울 수 있습니다. 따라서 이러한 견인력을 정량적으로 측정할 수 있는 방법은 매우 적으며, 특히 개별 세포 수준의 마이크로 및 나노 스케일에서는 더욱 그렇습니다. 인비트로(in vitro)에서 세포를 연구하는 대부분의 일반적인 방법은 유리 바닥 접시나 폴리스티렌 접시를 사용하는 것이었으나, 이러한 기질들은 매우 딱딱하여 세포가 유발하는 견인력과 변형을 실제로 물리적으로 측정하는 것이 불가능합니다.

따라서 물리적인 판독 방법 없이는 견인력의 근본적인 메커니즘을 이해하는 것이 매우 어려웠습니다. 이에 Chris Chen 교수 연구실에서는 이러한 한계를 극복할 수 있는 기술을 보유하고 있습니다. 저희의 방법은 유연한 캔틸레버의 수직 배열을 기반으로 하며, 개별 세포가 여러 캔틸레버에 걸쳐 퍼지면서 그 과정에서 캔틸레버를 굴곡시킬 수 있도록 강성과 크기 스케일이 설계되었습니다.

가장 빈번하게 사용하는 치수는 직경 3 µm, 높이 10 µm의 원통형 포스트이며, 직사각형 배열로 중심 간 간격은 9 µm입니다. 하지만 이러한 치수는 다양한 세포 연구에 맞게 변경될 수 있습니다. 먼저 여기 보이는 단단한 실리콘 마스터에서 시작하여, 이를 여기 보이는 유연한 PDMS 캔틸레버로 변환합니다.

이 기술을 사용하면 현미경 하에서 개별 캔틸레버의 굴곡을 측정할 수 있으며, 이러한 굴곡을 생성하는 데 필요한 크기와 방향을 가진 세포 견인력을 역산할 수 있습니다. 우리는 이러한 기판을 마이크로 포스트 어레이 검출기인 M pad로 제작하였으며, 본 영상에서는 실리콘 마스터부터 PDMS 복제, 그리고 최종적으로 변조 및 세포 수축성의 계산에 이르기까지 M pad를 제작하는 방법을 보여드리겠습니다. 안녕하세요, 여기는 저희 실험실의 클린룸입니다.

이곳은 먼지가 없고 빛에 민감한 방으로, 실리콘 마스터 역할을 할 SU-8 포스트를 제작하는 공간입니다. 먼저 실리콘 웨이퍼를 준비하고, 여기에 SU-8 감광제를 코팅합니다. SU-8은 음성 감광제로, 빛에 반응하는 성질이 있습니다. 따라서 포토마스크를 통해 빛을 쬐면 빛에 의해 마이크로 포스트 패턴이 형성되고 3차원 구조가 만들어지며, 이렇게 생성된 SU-8 포스트를 이용해 PDMS 캐스팅을 진행하게 됩니다.

모든 공정을 마친 후의 웨이퍼는 이런 모습이며, 여기에는 이미 제작된 마이크로 필러 및 마이크로 포스트 구조가 포함되어 있습니다. 마스터를 제작하기 위해, 우선 아무것도 처리되지 않은 실리콘 웨이퍼를 준비하고, 이를 오존 처리로 7분간 세척한 뒤 120 °C에서 30분 동안 탈수 처리하였습니다. 이제 포스트를 위한 매우 얇은 기저층을 형성하기 위해 이 위에 SU-8 2002를 스핀 코팅할 것입니다.

SU-8을 스핀 코팅할 예정이므로 가스 마스크를 착용하겠습니다. 웨이퍼를 이 홀더에 다시 장착하고, 묻어 있을 수 있는 먼지를 제거한 뒤 스핀 코터 위에 올립니다. 중심이 잘 맞았는지 확인한 후, 그 위에 SU-8 2002를 붓습니다. 그다음 웨이퍼를 회전시켜 스핀 코팅을 진행합니다. 이후 웨이퍼를 핫플레이트에 올려 소프트 베이크(soft bake)를 수행합니다.

이후 1분 동안 이 과정을 수행합니다. 그런 다음 이를 95°C 핫플레이트로 옮깁니다. 그리고 2분 동안 이를 유지합니다.

공정이 완료되면, 이제 이를 가지고 마스크 얼라이너(mask aligner)에서 플러드 노광(flood exposure)을 진행하겠습니다. 자, 웨이퍼에 첫 번째 SU-8 층을 스핀 코팅했습니다. 이제 마이크로 포스트를 위한 첫 번째 기저층을 만들기 위해 웨이퍼 전체를 플러드 노광해야 합니다. 따라서 70 mJ의 노광량을 줍니다.

따라서 여기 있는 마스크 얼라이너(mask aligner)의 실제 빛 강도를 측정해야 합니다. 먼저 측정기를 마스크 얼라이너에 장착합니다. 그런 다음 빛을 조사합니다.

여기에 UV 광원이 있습니다. 실리콘 웨이퍼를 마스크 얼라이너에 적재하여 배치합니다. 이번에는 마스크를 사용하지 않으므로, 필름 전체를 노광할 수 있습니다.

셔터를 닫고 노출 시간을 1분으로 설정한 후 노출을 진행하겠습니다. 1분이 지나 시스템 작동이 완료되면 웨이퍼를 꺼낼 수 있습니다. 이제 노광 후 베이크(post-exposure bake)를 수행해야 합니다.

웨이퍼 노광을 마쳤으며, 이제 첫 번째 SU-8 코팅층의 가교 반응을 유도하기 위해 열을 가하겠습니다. 먼저 65°C 핫플레이트 위에 1분 동안 올려둔 다음, 95°C 핫플레이트로 옮겨 2분 동안 유지합니다. 2분간의 공정이 끝난 후 핫플레이트 전원을 끄고 웨이퍼가 상온으로 식을 때까지 기다리며, 이 과정은 약 30분이 소요됩니다.

이제 웨이퍼 위에 두 번째 SU-8 층을 스핀 코팅했습니다. 이제 포토마스크를 통해 이를 노광해야 합니다. 이번에는 심자외선(deep UV)을 차단하기 위해 UV 필터를 사용할 것입니다.

이것은 구할 수 있는 Hoya 광학 유리입니다. 이번에는 강도를 다시 측정해야 합니다. 따라서 광도계를 사용하거나, 상단에 필터를 장착하여 필터링된 강도를 측정할 것입니다. 그런 다음 마스크 정렬기에 마스크를 장착하겠습니다.

이 스위치를 켜면 마스크를 고정하는 진공 상태가 생성됩니다. 그런 다음 마스크를 마스크 정렬기에 배치합니다. 그 위에 필터를 올린 후 웨이퍼를 로드합니다.

밀착 상태가 양호한지 확인하기 위해 웨이퍼를 위로 올려 밀착시킨 후 노광을 시작합니다. 노광이 끝나면 마스크 정렬기에서 웨이퍼를 꺼냅니다. 이제 선택적으로 노광된 영역이 생성되었습니다. 이를 오븐이나 핫플레이트로 가져가 노광 후 베이크(post-exposure bake)를 수행합니다.

최종 노광 후 베이크(post-exposure bake)를 마쳤으므로, 이제 3차원 구조를 구현하기 위해 웨이퍼를 현상하겠습니다. PGMEA로 세척 및 현상을 진행하여 노광되지 않은 SU-8을 제거하겠습니다. 먼저 PGMEA가 담긴 용기에 웨이퍼를 넣고 2분 동안 가볍게 흔들어 줍니다.

따라서 이를 2분 동안 그대로 둡니다. 그 다음 P-G-M-E-A가 담긴 두 번째 디쉬로 옮깁니다. 이렇게 하면 SU-8로 인해 포화된 P-G-M-E-A가 제거됩니다.

10초 후 IPA에 넣습니다. 이렇게 하면 PGMEA가 씻겨 나갑니다. 가볍게 흔들어 주며 20초 동안 담가 둡니다.

그리고 현재 독립형 포스트 구조체가 형성되었습니다. 이제 이를 표면 장력이 낮은 hexane에 넣겠습니다. 첫 번째와 두 번째 hexane에서 각각 5초 동안 세척한 후, 공기 건조를 진행하겠습니다.

웨이퍼 현상을 마쳤으므로 이제 웨이퍼를 핫플레이트에 올리고 온도를 150°C까지 천천히 올리겠습니다. 이렇게 온도를 높이면 SU-8의 가교 결합이 더욱 진행되어 구조적 강성이 높아지며, 이 상태로 핫플레이트 위에서 하룻밤 동안 유지합니다. 대략 14에서 20시간 정도 유지한 후, 핫플레이트 전원을 끄고 다시 상온으로 식힙니다.

따라서 저희가 해야 할 일은 이 웨이퍼를 더 작은 크기로 다이싱하는 것입니다. 기본적으로 이 실리콘 웨이퍼를 절단하여 여기 있는 내부 패턴만 포함된 작은 칩을 만들고자 합니다. 그리고 에폭시를 사용하는 저 구조와 같은 형태가 될 것입니다.

이제 이 칩을 다음과 같이 유리 슬라이드 위에 접착하겠습니다. 이렇게 하면 구조적인 지지대가 형성됩니다. 웨이퍼를 다이싱하는 것은 일종의 기술이 필요한 작업인데, 기본적으로 다이아몬드 스크라이버를 사용하여 한쪽 가장자리부터 시작하면 됩니다.

결정면으로 인해 작은 노치를 만들면 균열이 생기며, 이때 이 도구로 가볍게 두드려 줍니다. 그러면 이 부분을 벗겨낼 수 있고, 이와 같은 작은 구조가 될 때까지 계속 절단합니다. 그런 다음 실리콘 칩을 유리 위에 빠르게 배치하고 고정시킨 후, 그대로 굳힙니다.

완료 후에는 이와 유사한 장치를 얻게 됩니다. 실리콘 마스터를 이 유리 슬라이드 위에 장착했으며, 이제 PDMS에서 나중에 이 구조를 분리하는 데 도움이 되는 fluorinated silane 코팅을 입힐 것입니다. 칩을 이 데시케이터에 넣고, trichlorosilane을 몇 방울 떨어뜨려 데시케이터 안에 넣습니다.

이 과정에서 상당히 자극적인 부산물인 염화수소 가스가 발생하므로 후드 내부에서 진행합니다. 덮개를 닫고 진공 장치에 연결한 후, 진공 상태로 유지하며 하룻밤 동안 증착시켜 실리콘 웨이퍼 전체에 고른 코팅층이 형성되도록 합니다. 안녕하세요, Wesley Ligan입니다.

저는 Christopher Chen 교수님 연구실의 대학원생입니다. 지금까지 Nate가 ED 기판을 위한 실리콘 마스터 제작 방법을 설명해 드렸습니다. 하지만 이 도구를 사용하여 세포 수축력을 측정하기 전에, 먼저 엘라스토머 실리콘 폴리머를 이용해 강성 광 구조물을 복제해야 합니다.

첫 번째 작업은 앞서 제작한 실리콘 마스터의 음각 템플릿을 생성하는 것입니다. 이를 위해 PDMS 또는 폴리메틸실록산(Polymethyl siloxane)이라고 불리는 실리콘 엘라스토머를 사용합니다. 이제 PDMS 폴리머에 10:1 비율로 경화제를 첨가합니다.

용량 측정을 마친 후에는 PDMS 폴리머와 가교제를 충분히 혼합해야 합니다. 이 혼합 과정에서 용액에 많은 기포가 유입됩니다. 따라서 이 단계에서 용액을 덮고 진공 데시케이터에서 기포를 제거하는 탈기 과정이 필요합니다.

PDMS의 가스가 완전히 제거되고 모든 기포가 표면으로 올라와 터지면, 진공 데시케이터에서 꺼낼 수 있습니다. 이제 PDMS와 가교제가 혼합된 이 용액을 사용하여 실리콘 마스터의 음각 몰드를 제작할 수 있습니다. 이를 위해 파이 틴(pie tin)을 사용하고, 고정된 실리콘 마스터를 그 중앙에 배치합니다.

그런 다음, 추가 기포가 형성되지 않도록 주의하며 실리콘 웨이퍼 상단의 디쉬에 DGA 폴리머 용액을 조심스럽게 붓습니다. 일반적으로 폴리머를 약 1/4인치 두께로 붓습니다. 이 과정에서 혼합물 내에 약간의 공기 기포가 불가피하게 유입되는 것을 볼 수 있습니다.

이제 기포가 표면으로 올라와 터질 수 있도록 이 디쉬를 약 30분 동안 그대로 둡니다. 그대로 둔 후에도 PDMS 표면에 여전히 몇 개의 기포가 남아 있는 것을 볼 수 있습니다. 하지만 이 기포들은 최상층 표면에 있으므로, 이제 질소를 빠르게 분사하여 남은 기포들을 모두 터뜨릴 수 있습니다.

PDMS와 가교제(CROSSLINKER) 용액을 완전히 가교시켜 실리콘 마스터의 견고한 음각 템플릿을 생성하기 위해, 110 °C에서 20분 동안 가열합니다. 실리콘 기판 위에 얇은 PDMS 층이 형성된 것을 확인할 수 있습니다. 두 층을 분리하기 전에 먼저 이 층을 잘라내야 합니다.

그런 다음 이 최상층을 그라프팅하고 실리콘 기판에서 조심스럽게 벗겨낼 수 있습니다. 이 시점에서 음각 실리콘 기판, 즉 음각 PDMS 기판을 뒤집어 실리콘 마스터에서 매우 천천히 떼어낼 수 있습니다. 한쪽 끝을 누른 상태에서 PDMS 기판을 조심스럽게 벗겨내어 이를 수행합니다.

기판이 실리콘 마스터에서 벗겨지면서 전면이 전진하는 것을 볼 수 있습니다. 이제 실리콘 마스터의 A-P-D-M-S 음각 몰드를 생성했으므로, 이를 4개의 개별 음각 몰드로 절단하여 최종 패드 기판을 만들 수 있습니다. 이 시점에서 표면 손상을 방지하기 위해 포셉이나 장갑으로 음각 기판의 윗부분을 만지지 않는 것이 중요합니다.

따라서 현재 단계에서는 직경 3 µm, 깊이 9 µm의 웰로 구성된 실리콘 마스터로부터 4개의 개별 음각 템플릿을 제작하였습니다. 돌출된 캔틸레버 표면을 다시 재생하기 위해, PDMS를 이용해 이 음각 몰드 위에 PDI PDMS를 다시 캐스팅할 수 있습니다. 하지만 그 전에, 플루오로코팅을 통해 이 음각 몰드들이 비점착성 상태가 되도록 만드는 과정이 필요합니다.

이 과정을 100W 플라스마 챔버에서 최대 출력으로 1분 동안 수행합니다. 챔버의 펌프 다운(pump down) 후 플라스마를 다시 가동하면 이온 가스장이 생성되어 PDMS 상단 표면을 식각하며, 이를 통해 fluoro Cy Lane 분자와의 접착력이 향상됩니다. 진공 데시케이터에서 네거티브 몰드(Mold)를 제거하면, 비접착성 PDMS 층에 3 µm x 10 µm 깊이의 웰(well) 배열이 형성된 것을 확인할 수 있습니다.

mpad 기판에 사용할 수직 캔틸레버를 재생성하기 위해서는, 동일한 PDMS 혼합물을 사용하여 다시 캐스팅해야 하며, 이를 통해 앞서 제작한 실리콘 마스터와 동일한 형태를 가진 엘라스토머 캔틸레버의 독립형 양각 어레이를 얻을 수 있습니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 비접착성 음각 몰드를 PDMS 스트립과 유리 현미경 슬라이드로 제작한 마운팅 지그로 옮기는 것입니다. 이 장치를 사용하는 이유는 다음 단계에서 명확해질 것입니다.

이제 각 음각 몰드의 상단 표면에 이미 탈기(degas) 처리를 마친 PDMS와 가교제의 10:1 혼합물을 소량 떨어뜨립니다. PDMS가 음각 몰드의 가장자리로 흘러넘치지 않도록 소량만 사용해야 합니다.

몰드의 상단 표면에 PDMS를 더 충분히 퍼뜨리기 위해, 핀셋으로 몰드 하나를 잡아 뒤집은 다음 인접한 몰드와 접촉시켜 PDMS를 조심스럽게 펴서 기판 전체를 완전히 덮습니다. 이 단계에서 상단 PDMS 용액에 기포가 더 유입되지 않도록 각별히 주의하며, 나머지 두 개의 웰 및 두 개의 몰드에 대해서도 동일하게 반복합니다. 이제 상단 표면에 PDMS 코팅이 더 균일하게 되었으므로, 이 지그를 진공 데시케이터에 넣어 네거티브 몰드 상단의 PDMS 필름에 갇혀 있을 수 있는 기포를 추가로 제거합니다.

이 과정은 보통 약 30분 정도 소요됩니다. 음각 몰드의 가스 제거(degassing)가 진행되는 동안, 패드의 최종 장착 장소가 될 22 by 22 밀리미터 유리 기판을 세척할 수 있습니다. 이 과정의 첫 번째 단계는 압축 질소를 사용하여 먼지 입자를 불어내는 것입니다.

유리 커버슬립을 가스 플라스마에 노출시켜 표면을 애싱(ash)함으로써, 다음 단계에서 부착할 PDMS에 대한 접착력을 높입니다. PDMS 상층부를 약 30분 동안 DGA 처리하고 유리 커버슬립을 플라스마 활성화한 후, 템플릿을 제거하고 가스 플라스마에 노출된 유리 커버슬립의 윗면을 네거티브 몰드 위의 PDMS 층에 접촉시킵니다. 일반적으로 유리 커버슬립의 한쪽 가장자리를 먼저 PDMS에 접촉시킨 다음, 유리 커버슬립의 나머지 부분이 서서히 내려앉게 하여 PDMS가 시트 형태로 펼쳐지도록 하는 것이 좋습니다.

이렇게 하면 PDMS 필름에 유입된 기포를 줄일 수 있습니다. 이 단계에서 핀셋으로 유리 커버슬립의 상단 표면을 가볍게 눌러 과잉 PDMS를 밀어내고, 커버슬립을 템플릿 중앙의 PDMS 십자 표시 쪽으로 밀어 맞춥니다. 이렇게 하면 PDMS가 경화되는 동안 커버슬립이 움직이는 것을 방지할 수 있습니다.

다른 기판들에 대해서도 이 과정을 반복합니다. 이제 템플릿 전체를 오븐으로 옮겨 110 °C에서 22시간 동안 굽습니다. 전체 조립체가 실온으로 식을 때까지 기다린 후, 기판을 꺼내 뒤집고 유리 커버 슬립에서 네거티브 몰드를 조심스럽게 벗겨냅니다.

포스트가 뭉개지거나 유리 기판에서 떨어져 나가는 것을 방지하기 위해, 이 과정을 천천히 그리고 균일하게 진행하는 것이 중요합니다. 네거티브 몰드를 벗겨내면 실리콘 마스터를 정밀하게 모방한 캔틸레버 배열이 남게 되는데, 다만 이제는 유연한 PDMS 엘라스토머로 제작되었다는 점이 다릅니다. 자, 이제까지 Emad 기판의 실리콘 마스터를 생성하는 방법을 살펴보았습니다.

그 다음, A-P-D-M-S 엘라스토머 폴리머를 사용한 복제 성형 공정을 통해 정밀한 복제품을 제작하여, 캔틸레버가 유연하게 움직여 세포가 퍼지고 수축하면서 캔틸레버를 휘게 할 수 있도록 했습니다. 이제 기판이 세포 배양 처리를 위한 준비가 되었습니다. EDS를 만들기 위한 몰드 제작 및 복제 방법을 살펴보았으므로, 이제 세포를 배양하고 이후에 견인력을 분석할 수 있도록 EDS를 기능화하는 몇 가지 단계를 더 진행하겠습니다.

하지만 그전에 세 가지 작업을 수행해야 합니다. 먼저, 포스트의 끝부분이 세포에 잘 접착되도록 처리해야 합니다. 둘째로, 포스트의 굴곡을 시각화하고 분석하는 데 도움이 되도록 PDMS를 형광 표지해야 합니다.

셋째로, 견인력이 포스트 끝단에서만 작용하도록 포스트의 측벽과 바닥면을 세포 비부착성으로 만들어야 합니다. 따라서 이어지는 과정에서 마이크로 접촉 인쇄 기반 전략을 통해 이러한 단계들이 어떻게 진행되는지 살펴보겠습니다. 하지만 그전에, 다음 단계로 에칭된 부분에서 과잉의 PDMS를 제거해야 합니다.

앞서 언급했듯이, 첫 번째 단계는 EDS 기판을 준비하는 것입니다. 방금 West가 기판을 생성하고 다듬는 방법을 보여주었습니다. 유리 커버 슬립을 음각 몰드에 밀착시켜 경화시킨 후, 날카로운 면도날을 사용하여 발생한 과잉 PDMS를 제거합니다. 면도날을 기둥 가장자리의 기판 위에 수직으로 세워 놓은 다음, 긁어내어 과잉 PDMS를 제거하면 됩니다.

커버 슬립이 움직이지 않도록 손가락 하나로 고정할 수 있습니다. 이렇게 하면 이물질이 제거되어 쉽게 접근 가능한 M pad 기질이 완성됩니다. 다음 단계에서는 MPA를 마이크로 접촉 인쇄하여 포스트의 끝부분에 접착성을 부여해야 합니다.

이를 위해 먼저 스탬프를 제작해야 하며, 이 과정은 매우 간단합니다. PDMS를 10:1 비율 대신 1:30:1 비율로 혼합합니다. PDMS의 높이가 약 1cm가 되도록 페트리 접시에 붓습니다.

가스를 제거하십시오. 즉, 기포가 PDMS 상단으로 올라오게 한 뒤, 오븐에서 60°C로 1시간 동안 가교 반응을 경화시킵니다. 오븐에서 접시를 꺼내 식힌 후, 이제 스탬프를 잘라낼 준비가 되었습니다. 다시 한번, 동일한 종류의 면도날을 사용하여 PDMS를 수직 아래 방향으로 눌러 페트리 접시 바닥에 닿을 때까지 자릅니다.

이제 스탬프의 방향에 주의해야 합니다. 스탬프 표면은 평평한 상태를 유지할 수 있도록 페트리 접시 바닥에 닿아 성형된 PDMS 면이 되어야 합니다. 따라서 제가 잘라낸 이 커다란 정사각형 PDMS 조각의 경우, 현재 스탬프 표면이 위를 향하고 있습니다.

이제 이 스탬프는 M 패드보다 훨씬 크기 때문에, 면도날로 잘라 다시 단일 M 패드 크기로 다듬겠습니다. 스탬프의 올바른 방향을 육안으로 구별하기 매우 어렵기 때문에, 다음과 같이 스탬프의 뒷면(비접촉면)에 작은 홈을 내겠습니다. 그런 다음 더 큰 슬랩에서 스탬프를 떼어낼 수 있습니다. 이제 다음 단계를 위한 A-P-D-M-S 스탬프가 준비되었습니다.

PDMS 스탬프를 세척하고자 합니다. 스탬프를 절단하는 과정에서 대기 중의 먼지가 PDMS 스탬프 위에 내려앉았을 가능성이 매우 높기 때문입니다. 이 과정에서는 필요한 수의 PDMS 스탬프를 결정화 접시에 넣고, 결정화 접시에 100% ethanol을 채웁니다.

스탬프의 표면이 잠길 정도로 충분한 양의 에탄올을 첨가하되, 첨가하는 에탄올의 정확한 양은 중요하지 않습니다. 그런 다음 결정화 디스크를 장치에 넣고 스탬프를 5분 동안 초음파 처리합니다. 5분이 지나면 스탬프의 멸균 과정을 마치고, 나머지 마이크로 컨택 프린팅 단계인 M 패드의 기능화를 멸균 조직 배양 후드 내에서 진행합니다.

이제 조직 배양 후드 내에서 스탬프 멸균 과정을 마무리하겠습니다. 이를 위해 결정화 접시에서 스탬프를 꺼내 에탄올이 담긴 접시에 담가 남아 있는 잔해물을 씻어내고, 마지막으로 물이 담긴 접시에 담가 에탄올을 헹굽니다. 그 다음 질소 기류를 이용하여 스탬프에 가시적인 방울이 더 이상 남지 않을 때까지 건조합니다.

다음 단계에서는 스탬프에 단백질 용액을 잉킹해야 합니다. 사용할 단백질 용액은 DEI water에 녹인 50 µg/mL 농도의 fibrin입니다. 피펫으로 단백질 용액을 적당량 취한 후, 스탬프 표면에 단백질 용액을 떨어뜨립니다.

스탬프 표면 가장자리에 작은 방울들을 떨어뜨려 이 작업을 수행합니다. 먼저, 사용할 모든 스탬프에 대해 이 과정을 반복하며, 이 작업은 사전에 완료해 두어야 합니다. 모든 스탬프 가장자리에 방울을 배치한 후의 다음 단계는, 이 방울들을 연결하여 스탬프 표면을 단백질 용액으로 채우는 것입니다.

이렇게 처리한 이유는 단백질 용액이 액적 내에 존재하고 액적 아래로 퍼지면서 스탬프 표면을 친수성으로 만들어, 세포외 기질 단백질이 더 쉽게 퍼지도록 하기 위해서입니다. 따라서 사용하는 모든 스탬프에 대해 이 과정을 반복하십시오. 이제 스탬프 표면에 단백질 용액을 도포했으므로, 스탬프 잉킹의 마지막 단계는 가장자리까지 모두 덮였는지 확인하는 것입니다. 이를 위해 피펫을 비스듬히 기울여 스탬프 표면을 따라 움직이게 하여 PDMS 스탬프의 모서리와 단백질 용액이 모두 접촉하도록 합니다.

잉크를 도포하는 모든 스탬프의 모든 모서리에 대해 이 과정을 반복합니다. 스탬프 잉킹이 완료되면, 단백질이 스탬프 표면에 완전히 흡수되도록 조직 배양 후드 내에 1시간 동안 둡니다. 단백질이 스탬프 표면에 흡수되도록 1시간을 기다렸으므로, 이제 물로 헹군 후 질소 가스로 건조시킵니다.

이를 위해 멸균수를 준비하여 스탬프가 들어 있는 디쉬에 붓습니다. 이때 물을 스탬프 표면에 직접 붓지 않도록 주의하며, 필요한 경우 피펫을 사용할 수 있습니다. 물의 높이가 단백질 용액보다 높아지기만 한다면 정확한 물의 양은 중요하지 않습니다.

그 다음, 멸균 핀셋을 사용하여 스탬프 하나를 집어 새 증류수 디쉬에 담근 후, 질소 가스로 부드럽게 불어 건조시킵니다. 스탬프 표면에서 단백질 용액 방울이 더 이상 보이지 않으면 건조된 것입니다. 처리 중인 모든 스탬프에 대해 이 과정을 하나씩 반복합니다.

이제 스탬프를 헹구어 말렸으므로, UV 오존 처리를 통해 mpad 기판을 활성화할 차례입니다. 7분 동안 처리하기 위해, 페트리 접시의 뚜껑을 위에서 제거합니다. 폴리스티렌은 UV를 흡수하기 때문입니다. 그런 다음 접시를 UV 오존 처리기에 넣고 서랍을 닫은 후, 시간을 7분으로 설정하고 작동시킵니다.

이제 다시 조직 배양 후드 내로 돌아와, 방금 UV-오존 처리를 마친 mpad 기판에 스탬프를 찍을 차례입니다. 이를 위해 세척 및 건조된 스탬프를 핀셋으로 들어 올리십시오. 스탬프의 측면을 잡고 다루되, 스탬프의 면은 만지지 마십시오.

단백질 면이 닿을 수 있도록 포셉의 스탬프 위치를 조정합니다. 그 다음, 단백질 면이 아래로 향하도록 포셉을 뒤집어 스탬프를 eds에 천천히 접촉시킵니다. 1~30번 스탬프는 상당히 끈적거리므로, 포셉에서 스탬프를 떼어내기 위해 두 번째 핀셋을 사용해야 할 수도 있습니다.

스탬프를 약 2 mm에서 8 mm 정도의 높이에서 emed 위로 떨어뜨립니다. 그다음 emed가 담긴 디쉬를 기울이고 포셉으로 가볍게 눌러 스탬프와 ed 사이의 접촉을 유도합니다. 접촉 여부는 다음 두 가지 방법 중 하나로 확인할 수 있습니다.

첫 번째 방법은 스탬프 측면을 통해 ED 표면을 살펴보는 것입니다. 카메라로는 확인하기 어려울 수 있으나, 육안으로 스탬프 측면을 통해 표면을 보면 스탬프가 표면에 접촉하고 있음을 분명하게 확인할 수 있습니다. 접촉 여부를 확인하는 두 번째 방법은 뚜껑을 닫은 상태로 페트리 접시를 조직 배양 후드 밖으로 꺼내 도립 현미경으로 관찰하는 것입니다.

현미경으로 간섭 무늬를 시각화함으로써 스탬프가 eds와 접촉했는지 여부와 접촉 시점을 확인할 수 있습니다. 접촉이 확인되면 스탬프를 ed 기판에 수 초 동안만 접촉 상태로 유지하면 됩니다. 이제 스탬프를 제거할 시간입니다.

이를 위해 핀셋 한 쌍으로 끝부분(ends)을 아래로 접은 다음, 한 번의 부드러운 동작으로 스탬프를 떼어냅니다. 어떤 끝부분에 스탬프를 찍었는지, 그리고 어떤 스탬프를 이미 사용했는지 반드시 확인하십시오. 사용하려는 모든 기판에 대해 EMPA당 이 절차를 한 번씩 반복합니다.

이제 EMPA를 스탬핑했으므로, 다음 단계는 이를 멸균한 후 Dye Eye라고 불리는 친지성 염료에 배양하는 것입니다. Dye Eye는 형광 표지된 친지성 분자로, 일정 시간 동안 PDMS 내부로 확산되어 현미경 하에서 포스트의 굴절을 시각화할 수 있게 해줍니다. 이제 각각의 EMPA 기판을 하나씩 차례대로 100% 에탄올, 70% 에탄올, 그리고 DI water에 담글 것입니다.

마지막으로, 5 µg/ml 농도의 DiI 용액을 준비합니다. DiI 용액은 형광성으므로, 주변 빛에 노출되는 것을 줄이고 광탈색을 최소화하기 위해 조직 배양 후드에서 1시간 동안 배양하는 동안 디쉬를 알루미늄 호일로 덮어줍니다. EM 패드가 DiI 용액에서 1시간 동안 배양되었으므로, 이제 알루미늄 호일을 제거하고 DiI 용액을 헹궈냅니다.

멸균수로 세 차례 연속 침지하여 세척한 후, 마지막으로 0.2%onic F1 27 용액에 침지합니다. 이때 농도는 0.2% w/v입니다. 모든 침지 단계 동안 EM 패드가 공기에 노출되는 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. 이는 ED 기판의 손상을 방지하고, 특히 두 기둥이 서로 무너져 내리는 것을 방지하기 위함입니다.

0.2% F1 27은 친수성 도메인과 소수성 도메인으로 구성된 트리블록 공중합체입니다. 친수성 도메인은 단백질 흡착과 그에 따른 세포 부착을 억제하는 것으로 알려져 있으며, 소수성 도메인은 소수성 PDMS에 결합합니다. 따라서 PDMS를 F1 27에 담그면, F1 27이 PDMS에 결합하여 세포 부착을 방지합니다.

알루미늄 호일로 덮인 페트리 접시에서 chronic F1 27에 1시간 동안 배양한 후, 멸균수, 멸균수 및 PBS에 순차적으로 침전시켜 F1 27을 씻어냅니다. PBS에 침전시켜 F1 27 제품을 모두 씻어낸 후, 기판을 선택한 세포 배양액에 침전시킵니다. EMPA를 침전시킨 세포 배양액에는 혈청 및/또는 기타 성장 인자, 그리고 페니실린 및 스트렙토마이신과 같은 보충제가 포함될 수 있습니다.

이 모든 성분들은 EMPA 처리와 완전히 호환됩니다. 이제 eds를 세포 배양액에 침지시킨 후 다음 단계는 선택한 세포를 eds 위에 파종하는 것입니다. 이번 특정 실험 설정에서는 소 폐동맥 내피세포를 세 개의 서로 다른 디시에 파종하겠습니다.

세 개의 서로 다른 디쉬를 사용하는 이유는, 나중에 분석할 수 있도록 두 개의 디쉬에 알려진 촉각 억제제(tactility inhibitors)를 처리하여 포스트의 굴곡을 억제하기 위해서입니다. 세포를 파종하기 위해, 세포 현탁액에서 적절한 양을 피펫으로 취해 각 디쉬에 한 방울씩 떨어뜨립니다. 견인력(traction forces)을 측정하는 분석을 수행할 때 세포들이 eds 상에서 단일 세포 상태로 존재할 수 있도록 충분한 양의 세포를 추가합니다.

첨가하는 양은 배양 면적과 사용하는 세포의 성장 속도에 따라 달라집니다. 일반적으로 기질 1cm²당 1500에서 5,000개의 세포를 분주합니다. 세포 분주를 완료하거나 세포 현탁액을 방울 단위로 모두 옮긴 후, 배양 접시 내에서 세포 현탁액이 잘 섞이도록 접시를 서로 직교하는 방향으로 여러 번 부드럽게 앞뒤로 흔들어 줍니다.

사용하는 모든 기질에 대해 이 과정을 반복하십시오. 세포를 파종한 직후, pH와 세포 배양 배지를 완충할 수 있도록 적절한 이산화 탄소 농도가 유지되는 37 °C 배양기에 넣으십시오. 세포 파종 후 약 2시간 뒤에 기질을 기존의 배지가 담긴 접시에서 동일한 세포 배양 배지가 담긴 새 접시로 옮겨 세포를 헹구는 것이 적절합니다.

이렇게 헹구는 이유는 대부분의 세포가 2시간 이내에 퍼지기 시작하여 거의 최종 확산 면적에 도달하기 때문입니다. 세포와 기판을 헹굼으로써 세포 배양 배지 내의 부유 세포들을 제거할 수 있습니다. 그렇게 함으로써 EDS에 부착되어 확산 과정을 시작한 세포들만이 견인력 측정을 위한 최종 분석 단계에서 나타나게 됩니다.

MPA에서 배양된 세포를 통해 수행할 수 있는 분석 중 하나는 세포 수축성의 역학을 정량적으로 조사하기 위한 타임랩스 이미징(time-lapse imaging)입니다. 특히 가용성 인자에 반응하는 세포 수축성의 역학은 매우 흥미로운 부분입니다. 생물학적 화합물 및 합성 화합물과 같은 가용성 인자들은 세포 수축성을 증가시키거나 감소시키며, 때로는 알려지지 않은 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다.

이번 살아있는 세포 실험에서는 이 도립 에피 형광 현미경을 사용할 것입니다. 현미경 스테이지 위에는 온도 조절기에 연결된 소형 인큐베이터 박스가 있어 37 °C의 온도와 5% CO2 농도를 유지합니다. 60x Plan APO 대물렌즈를 사용하여 고배율로 이미징을 진행하겠습니다.

이제 이미징을 위한 충격 기질을 준비하겠습니다. 이미징에 사용하는 60x 대물렌즈의 작동 거리는 200 microns인데, 이는 앞서 세포를 파종한 조직 배양 접시의 두께보다 훨씬 짧습니다. 따라서 조직 배양 접시 내의 임플란트에 있는 세포를 이미징할 수 없습니다.

이 문제를 해결하기 위해, 이러한 글래스 바텀 디쉬(glass bottom dish)를 사용합니다. 이제 기판을 글래스 바텀 디쉬에 뒤집어 옮겨서, 세포와 포스트의 팁이 글래스 바텀 디쉬의 인터페이스에 위치하도록 하겠습니다. 따라서 이를 현미경에 놓았을 때, 세포와 대물렌즈 사이의 작동 거리(working distance)는 200 µm 미만이 됩니다.

이제 이미징을 위해 현미경에 올릴 준비가 되었습니다. 라이브 셀 인큐베이터 챔버를 열고 샘플을 안에 넣은 뒤 인큐베이터 챔버 덮개를 닫겠습니다. 이 단계에서 기질을 스캔하여 적절한 세포를 찾겠습니다.

이미징을 위해, 가장 효율적인 방법은 10배 위상차 대물렌즈를 사용하는 것입니다. 이를 통해 기질의 더 넓은 시야를 관찰하고 세포를 더 빠르게 찾을 수 있습니다. 좋은 세포의 선정 기준은 단일 세포여야 한다는 것입니다.

인접한 다른 세포와 접촉하지 않아야 하며, 기질 위의 다른 모든 세포와 비교했을 때 크기가 평균적이어야 합니다. 관찰하기에 적합한 세포를 찾았습니다. 다음 단계로, 세포를 고배율로 관찰하기 위해 대물렌즈를 60 x로 교체하겠습니다. 이를 위해 대물렌즈의 초점을 흐리게 하여 회전 중에 스테이지와 충돌하지 않도록 합니다.

터렛을 회전시키는 동안 챔버를 엽니다. 60x 대물렌즈를 부분적으로 회전시킵니다. 60x 대물렌즈는 오일 침지 렌즈이므로, 대물렌즈 위에 침지 오일을 한 방울 떨어뜨려야 합니다. 이제 터렛 회전을 완료하여 60x 렌즈를 정위치에 맞춥니다. 인큐베이터 챔버를 닫고 대물렌즈의 초점을 다시 맞춰 세포가 다시 선명하게 보이도록 합니다.

세포의 위치와 초점을 미세하게 조정한 후, CCD 카메라로 전환하여 컴퓨터 화면으로 세포를 미리 확인하고 타임랩스 이미징을 시작합니다. 본 실험에서는 위상차 이미지와 형광 이미지를 모두 1분 간격으로 수집하겠습니다. 타임랩스 이미징이 시작되었으며 10분 동안 또는 10프레임까지 진행한 후 혈청을 첨가하겠습니다. 10분이 경과했습니다. 이제 챔버를 열고 디시에 혈청을 첨가하여 세포의 수축성을 자극하겠습니다.

타이머가 계속 작동하고 있으므로 빠르게 진행해야 합니다. 이제 수축력의 변화를 관찰하기 위해 30분 동안 세포 이미징을 계속하겠습니다. 타임랩스 이미징이 완료되면, 이미지들을 순차적으로 배열하여 다음과 같은 동영상을 만들 수 있습니다. 여기 위상차 및 형광 이미지 동영상 두 가지가 있습니다.

왼쪽은 검은색으로 윤곽이 표시된, 대부분 투명한 세포의 위상차 영상입니다. 이 세포는 직사각형 격자 형태로 배열된 원형 구조물인 20개의 포스트 끝부분에 걸쳐 퍼져 있습니다. 오른쪽은 동일한 세포의 형광 영상이며, 포스트만 보입니다.

이 영상들을 재생해 보면, 세포에 부착된 기둥들이 처음에는 약하게 휘어져 있으며 직사각형 격자에서 거의 벗어나지 않는 것을 볼 수 있습니다. 영상 중간쯤에 배지에 혈청을 추가했습니다. 혈청은 세포의 수축력을 증가시키도록 자극합니다.

세포가 하부의 포스트에 더 큰 견인력을 가함에 따라, 세포 주변부의 포스트들이 안쪽으로 굴곡되기 시작합니다. 형광 동영상에서 포스트들이 직사각형 격자 내 원래 위치에서 크게 벗어나는 것을 확인할 수 있습니다. 이후에 설명하겠지만, 이 이미지들에서 포스트 위치의 변위를 통해 해당 세포의 견인력을 분석할 수 있습니다.

앞서 mpad 기질을 생성하는 방법과 세포 배양을 위해 이를 기능화하는 방법을 살펴보았습니다. 이제 완성된 mpad 기질이 세 개의 서로 다른 세포 배양 접시에 담겨 있는 것을 확인하실 수 있을 것입니다. 세포는 밤새 성장했으며, 이제 각 세포 배양 접시에 수축력을 알려진 방식으로 조절하는 서로 다른 가용성 약물을 처리하겠습니다.

그 다음, 세포를 30분 동안 고정한 후 발생하는 견인력을 정량적으로 측정할 수 있습니다. 수용성 인자를 첨가하고 수축 억제제를 첨가한 지 30분이 지났으므로, 이제 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 세포를 고정하여 현재의 견인력 상태를 유지할 차례입니다. 이를 위해 칼슘과 마그네슘이 함유된 파라포름알데히드를 사용하는 것이 중요하며, 3.7%의 부피 백분율 농도로 사용합니다. 기판을 파라포름알데히드에 침지하는 방법은 기능화 과정 중 서로 다른 RINs에 기판을 침지했던 방법과 동일합니다.

즉, 기질이 마르지 않게 하는 것이 중요한데, 이는 기질 붕괴로 이어질 수 있기 때문입니다. 기질을 옮긴 후, 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에서 20분 동안 배양합니다. 20분이 지나면 파라포름알데히드에서 기질을 꺼내며, 이제 세포가 고정되었으므로 이 샘플들을 표준 면역 염색 공정에 사용할 수 있습니다.

이를 위해, 기질을 파라포름알데히드(param) 위에 앞면이 위로 향하도록 배치하고, 기질이 완전히 잠길 정도로 충분한 양의 PBS를 피펫으로 분주합니다. 그 다음, 배양액에 남아 있을 수 있는 파라포름알데히드를 제거하기 위해 기질을 PBS로 3회 세척합니다. PBS로 기질을 3회 세척한 후, 후속 면역 염색 과정을 위해 기질을 옮길 수 있습니다.

핀셋으로 기질을 잡고 면역 염색의 첫 번째 단계인 투과제 처리 단계에서 뒤집어 수행함으로써 이를 진행합니다. 여기서는 PBS에 0.2%Triton X를 사용합니다. 다만, 사용자는 자신의 필요에 가장 적합한 투과제를 사용할 수 있습니다.

모든 기질에 대해 이 과정을 반복하며, 이것이 면역 염색 과정 중 기질을 처리하는 방법입니다. 면역 염색 후, 기질을 표준 1인치 x 3인치 유리 슬라이드에 마운팅하며, 이후 도립 또는 정립 방식의 모든 에피 형광 현미경에서 처리할 수 있습니다. 공초점 현미경으로 시료를 처리함으로써, 포스트의 바닥면에 초점을 맞추어 굴곡이 없는 nul position을 얻을 수 있습니다.

그런 다음 포스트의 끝부분에 초점을 맞추고 포스트의 이미지를 다시 촬영합니다. 상단 이미지와 하단 이미지를 비교함으로써 포스트의 변형 정도를 측정하고, 이러한 변형을 일으키기 위해 세포가 생성한 견인력을 계산할 수 있습니다. 여러 가지 다른 조건에서 다양한 세포를 대상으로 이 과정을 반복함으로써, 서로 다른 조건에서 생성된 견인력을 비교할 수 있습니다. 이제 살아있는 세포와 고정된 세포의 이미지를 모두 수집했으므로, 다음 과제는 변형 정도를 측정하여 세포의 견인력을 측정하는 것입니다.

이를 위해 MATLAB으로 컴퓨터 프로그램을 작성하였습니다. 본 분석에 사용할 세 개의 이미지입니다. 첫 번째 이미지는 세포의 위상 이미지입니다.

이는 세포의 위치를 식별하는 데 유용합니다. 두 번째 이미지는 포스트 상단의 형광 이미지입니다. 이 이미지를 사용하여 포스트 끝단의 위치를 파악합니다.

보시는 바와 같이, 일부 포스트들은 굴절되어 대부분의 포스트들이 위치한 직사각형 격자에서 벗어나 있으며, 이 포스트와 저 포스트가 그러합니다. 세 번째로 사용할 이미지는 베이스 이미지로, 포스트들의 하단을 가로지르는 초점 평면에서의 포스트 위치를 포착한 것입니다.

이 단계에서는 굴곡된 포스트와 굴곡되지 않은 포스트 모두가 변형되지 않은 원래의 휴지 상태 위치에 있어야 합니다. 직사각형 격자 구조에서, 두 번째 이미지의 하단부에서 굴곡되었던 포스트들이 현재 평형 상태(FL position)에 있는 것을 확인할 수 있습니다. 이 이미지는 포스트의 굴곡되지 않은 위치를 찾는 데 사용됩니다.

다음으로, 세 개의 이미지를 불러오라는 안내가 표시될 MATLAB 프로그램을 실행합니다. 파일에 이름을 지정하십시오. 그러면 위상 이미지가 나타납니다.

프로그램이 어떤 기둥을 분석해야 하는지 인식할 수 있도록 세포가 있는 위치에 박스를 그립니다. 그 후 프로그램은 잘라낸 이미지의 강도 처리, 임계값 설정 및 정규화를 수행하여 기둥의 OID 좌표를 결정합니다. 왼쪽에는 상단 이미지에서 추출된 기둥의 정규화된 이미지들이 있으며, 오른쪽에는 하단 이미지에서 추출된 동일한 기둥들의 정규화된 이미지들이 있습니다.

포스트와 OID 좌표를 확보한 후, 프로그램은 각 포스트의 팁과 베이스 사이의 변위 벡터를 결정할 수 있습니다. 이러한 포스트 변위 벡터는 포스트의 스프링 상수를 곱하여 힘 벡터로 변환할 수 있습니다. 세포당 평균 힘 또는 포스트당 평균 힘과 같이 여러 가지 방법으로 이러한 세포력을 분석할 수 있습니다.

유용한 결과 중 하나는 힘의 공간적 분포를 시각화할 수 있는 퀴버 플롯(quiver plot)입니다. 이것이 방금 분석한 세포이며, 힘의 크기에 비례하고 힘의 방향을 가리키는 노란색 화살표를 포스트 위에 겹쳐 표시한 것을 볼 수 있습니다. 타임랩스 동영상에 필요한 이미지들과 같이 연속적인 이미지들에 대해 이 이미지 분석 과정을 반복함으로써, 시간적 순서에 따른 시퀀스를 생성할 수 있습니다.

혈청으로 자극한 세포의 영상입니다. 보시는 바와 같이, 혈청이 첨가되는 즉시 세포의 수축력이 증가하여 포스트를 더욱 많이 휘게 했습니다. 또한, 다양한 조건에 노출된 후 고정 및 염색된 더 많은 수의 세포에 대해 힘을 정량화할 수 있으며, 이는 대조군 화합물로 처리한 세포와 수축 억제제로 처리한 세포를 보여주는 이 퀴버 플롯(quiver plots)의 예시와 같이 나타낼 수 있습니다.

보시는 바와 같이, 대조군의 세포에 작용하는 힘 벡터는 수축 억제제를 사용한 두 가지 경우의 힘 벡터보다 길이가 더 길며 크기도 더 큽니다. 마이크로 제작부터 시료 준비, 실험 및 분석에 이르기까지 기판 경로를 설명함으로써 이러한 기판의 다용성(versatility)을 입증하기 위해 많은 내용을 다루었습니다.

우리는 살아있는 세포 이미징과 고정 시료 분석이라는 두 가지 서로 다른 분석법을 설명하였으며, 이 두 분석법으로 얻은 세포를 분석하여 퀴버 플롯(quiver plot)과 퀴버 영상(quiver movie)을 제시하였습니다. 이 강력한 도구를 통해 세포 수축력에 대한 다양한 공간적 및 시간적 분석을 수행할 수 있습니다. 보신 바와 같이, 이 방법은 미세 가공, 기초 세포 생물학, 표면 과학, 이미지 분석 및 처리 등 다양한 분야의 지식을 활용하였습니다.

이 방법론은 여러 가지 서로 다른 공학적 기술에 기반을 두고 있기 때문에, 포스트의 기하학적 구조, 유도된 수용성 인자, 포스트 굴곡 분석 방법과 같은 파라미터들을 사용자의 필요에 따라 맞춤 설정할 수 있습니다. 지난 20~30분 동안 설명드린 이 방법의 시각적 시연이 세포 견인력의 조절, 기능적 결과 및 생성에 관한 다른 더 심층적인 분석의 출발점으로 활용되기를 바랍니다.