Microfabricated 포스트 - 배열 감지기 (mPADs) : 기계적 힘을 분리하는 접근

안녕하세요, 저는 Nathan Snia Deky이고 오늘은 Wes Ligan, Robbie Desai, Mike Yang입니다. 저희는 펜실베이니아 대학의 크리스 첸 연구실에서 왔습니다. 이 비디오에서는 미세하게 제작된 포스트 배열을 사용하여 세포 인력을 측정하는 접근 방식을 제시합니다.

견인력은 미오신 및 액톤 상호 작용을 통해 생성되며 생리학에서 중요한 역할을 합니다. 발달 과정에서 세포가 한 위치에서 다음 위치로 이동하여 조직의 초기 구조를 형성할 수 있도록 합니다. 또한 치유 과정에도 도움이 되는데, 상처를 봉합하거나 백혈구가 우리 몸을 통해 이동하고 기어 다니는 데 필요하기 때문입니다.

그러나 불행히도 이러한 동일한 힘은 암, 전이 또는 종양을 향한 혈관 성장의 경우 건강에 해로울 수 있습니다. 따라서 이러한 견인력을 정량적으로 측정할 수 있는 방법은 거의 없으며, 특히 개별 세포의 마이크로 및 나노 규모에서 측정할 수 있는 방법은 거의 없습니다. 체외에서 세포를 연구하는 대부분의 일반적인 방법은 유리 바닥 접시나 폴리스티렌 접시를 사용하는 것이지만, 이것들은 매우 단단한 기질이며 그렇지 않기 때문에 세포가 유발하는 견인력과 명예 훼손을 실제로 물리적으로 측정할 수 없습니다.

그래서 일종의 물리적 판독 없이는 견인력의 기본 메커니즘을 이해하는 것이 매우 어려웠습니다. 그래서 크리스 첸의 연구실에서는 이러한 한계를 극복할 수 있는 기술을 가지고 있습니다. 우리의 방법은 유연한 캔틸레버의 수직 배열을 기반으로 하며, 그 강성과 크기 척도는 개별 세포가 여러 캔틸레버에 퍼져 그 과정에서 편향되도록 합니다.

우리가 가장 자주 사용하는 치수는 직경 3미크론, 직경 원통형 기둥, 높이 10미크론, 중심에서 중심까지의 간격 및 직사각형 어레이입니다. 그러나 이러한 치수는 다양한 세포 연구를 수용하기 위해 다양할 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있는 견고한 실리콘 마스터로 시작하여 여기에서 볼 수 있는 유연한 PDMS 캔틸레버로 변환합니다.

이 기술을 사용하여 현미경으로 개별 캔틸레버의 편향을 측정하고 이러한 편향을 생성하는 데 필요한 크기와 방향으로 세포 견인력을 되돌릴 수 있습니다. 우리는 이러한 기판을 마이크로 포스트 어레이 검출기를 위해 M 패드로 전환했으며, 이 비디오에서는 실리콘 마스터에서 시작하여 PDMS 복제를 거쳐 마지막으로 변조 및 세포 수축성 계산에 이르기까지 M 패드를 제작하는 방법을 보여줍니다. 안녕하세요, 여기 우리 연구실 클린룸에 있습니다.

이것은 실리콘 마스터 역할을 할 SU 8개의 기둥을 만들 수 있는 먼지가 없고 빛에 민감한 방입니다. 먼저 실리콘 웨이퍼로 시작하여 SU 8 포토 레지스트, SU 8, 네거티브 레지스트, 빛에 민감한 것으로 코팅합니다. 따라서 이 포토 마스크를 통해 빛을 비추면 빛이 마이크로 포스트를 패턴화한 다음 3차원 구조를 형성한 다음 PDMS에서 캐스팅한 SU 8개의 포스트가 됩니다.

따라서 모든 처리를 완료한 후 웨이퍼는 다음과 같이 보일 것이며, 여기에는 이미 웨이퍼로 제작된 마이크로 포스트 구조인 마이크로 필러가 있습니다. 그래서 마스터를 만들기 위해 먼저 베어 실리콘 웨이퍼로 시작하여 7분 동안 오존 처리로 세척하고 이 웨이퍼를 섭씨 120도에서 30분 동안 탈수했습니다. 우리는 SU 8 2002를 여기에 스핀하여 게시물에 대한 매우 얇은 기본 레이어를 형성할 것입니다.

그래서 우리는 SU 8을 돌릴 것이기 때문에 방독면을 착용하고, 여기 이 홀더에 웨이퍼를 다시 넣고, 저기에 있을 수 있는 먼지를 털어내고, 스피너에 올려 놓고, 중앙에 있는지 확인한 다음 그 위에 SU 8 2002를 붓습니다. 그런 다음 웨이퍼를 회전시킵니다. 그런 다음 이것을 핫 플레이트, 소프트 베이크에 놓습니다.

그 후 1분 동안 이 작업을 수행합니다. 그런 다음 그것을 가져 와서 95도 핫 플레이트로 옮깁니다. 그리고 우리는 이것을 2분 동안 합니다.

그리고 그것이 끝나면, 우리는 지금 이것을 가지고 마스크 교정장치에서 홍수 노출을 하러 갈 것입니다. 자, 이제 이 웨이퍼에서 SU 8의 첫 번째 레이어인 SU 8을 회전시켰고, 이제 전체 웨이퍼를 플러드 노출시켜 마이크로 포스트를 위한 첫 번째 베이스 레이어를 만들어야 합니다. 그래서 우리는 이 70밀리줄의 노출을 제공해야 합니다.

그런 다음 여기 마스크 교정장치에서 빛의 실제 강도를 측정해야 합니다. 그래서 우리는 미터를 마스크 교정장치에 무게를 넣습니다. 그런 다음 빛으로 노출시킵니다.

이것은 UV 광선입니다. 실리콘 웨이퍼를 마스크 얼라이너에 로드하고 마스크 얼라이너에 넣습니다. 그리고 이번에는 마스크가 없어서 영화 전체를 노출시킬 수 있습니다.

셔터를 누르고 1분 동안 노출을 조절하고 노출을 진행해 보겠습니다. 따라서 1분 후에 시스템이 완료되면 웨이퍼를 꺼낼 수 있습니다. 이제 노출 후 베이크를 해야 합니다.

이제 이 웨이퍼를 노출시켰고 이제 열을 가하여 SU 8의 첫 번째 코팅에 대한 가교 반응을 일으킬 것입니다. 그래서 우리는 그것을 65도 핫 플레이트에 1분 동안 놓고 2분 동안 95도 핫 플레이트로 옮깁니다. 2분 과정이 끝나면 핫 플레이트를 끄고 웨이퍼를 실온으로 다시 냉각시키는데, 이 과정에는 약 30분이 걸립니다.

그래서 우리는 SU 8의 두 번째 층을 이 웨이퍼에 회전시켰습니다. 이제 우리는 실제로 포토 마스크를 통해 이것을 노출시켜야 합니다. 이번에는 UV 필터를 사용하여 깊은 자외선을 차단

이것은 당신이 얻을 수 있는 Hoya 광학 유리이지만 이번에는 강도를 다시 측정해야 합니다. 그래서 우리는 조도계를 사용하거나 맨 위에 있는 필터를 사용하여 필터링된 강도를 측정할 것입니다. 그런 다음 마스크를 마스크 정렬기에 넣습니다.

이 스위치는 마스크를 제자리에 고정하는 진공을 생성합니다. 그런 다음 마스크 교정장치에 넣습니다. 그런 다음 필터를 위에 놓고 웨이퍼를 로드합니다.

우리는 접촉이 양호한지 확인하고 싶기 때문에 접촉하도록 들어 올린 다음 노출을 시작합니다.노출 후 마스크 얼라이너에서 웨이퍼를 꺼냅니다. 이제 우리는 선택적으로 노출된 영역을 가지고 있습니다. 우리는 이것을 오븐으로 가져갈 것이고, 뜨거운 접시로 가서 노출 후 베이킹을 할 것입니다.

우리는 방금 The po, 최종 노출 후 베이크를 완료했으며 이제 이 웨이퍼를 개발하여 실제로 3차원 구조를 얻을 수 있습니다. 우리가 할 일은 이것을 씻어내고, 이것을 P-G-M-E-A로 개발하여 노출되지 않은 SU 8을 씻어내는 것입니다. 그래서 우리는 먼저 P-G-M-E-A 한 접시로 시작하고 여기에 웨이퍼를 2분 동안 가볍게 교반하면서 앉힙니다.

그래서 저는 이것을 2분 동안 놓아두겠습니다. 그래서 우리는 P-G-M-E-A의 두 번째 요리로 옮길 것입니다. 이렇게 하면 SU 8로 포화된 P-G-M-E-A가 제거됩니다.

10초 후에 IPA로 가져옵니다. 이것은 P-G-M-E-A를 씻어냅니다. 우리는 그것을 여기에 20초 동안 넣었고, 다시 약간의 가벼운 교반과 함께

그리고 지금 우리는 독립된 기둥 구조물을 가지고 있습니다. 그래서 우리는 이것을 표면 장력이 낮은 헥산에 넣을 것입니다. 한 번에 5초 동안 씻은 다음 두 개의 헥산으로 씻은 다음 바람으로 건조할 준비가 되었습니다.

이제 막 웨이퍼를 개발했고 이제 웨이퍼를 핫 플레이트에 놓고 온도를 50도까지 천천히 올릴 것입니다. 그리고 이 더 높은 온도는 SU 8을 더 가교 연결하여 구조적으로 더 단단하게 만들고 우리는 그것을 밤새 이 핫 플레이트에 둡니다. 따라서 14시간에서 20시간 사이 및 그 후에 핫플레이트를 끄고 다시 실온으로 냉각시킵니다.

그래서 우리가 해야 할 일은 이 웨이퍼를 더 작은 크기로 깍둑썰기하는 것입니다. 우리는 기본적으로 이 실리콘 웨이퍼를 절단하고 여기에 이 내부 패턴의 작은 칩을 만들고 싶습니다. 그리고 그것은 그들이 에폭시를 사용할 곳에서이 구조와 비슷하게 보일 것입니다.

그리고 우리는 그 칩을 유리 슬라이드에 그렇게 붙일 것입니다. 그리고 이것은 구조적 뒷받침을 제공합니다. 그래서 웨이퍼를 주사위하는 것은 일종의 예술이지만 할 수 있는 것은 기본적으로 다이아몬드 스크라이브를 사용하고 한쪽 가장자리에서 시작하는 것입니다.

그리고 결정면 때문에 작은 노치를 넣기만 하면 균열이 생겨나서 이 도구로 두드릴 수 있습니다. 이것을 벗겨낼 수 있고 이와 같은 작은 구조를 얻을 때까지 여기에서 더 많은 절단을 할 수 있습니다. 그런 다음 실리콘 칩을 유리에 빠르게 놓고 제자리에 장착합니다. 그리고 당신은 그것을 놓았습니다.

그래서 여러분이 작업을 마치고 나면, 여러분은 이와 비슷한 장치를 갖게 될 것입니다. 그래서 우리는 이 유리 슬라이드에 실리콘 마스터를 장착했고 이제 플로이 코팅을 할 것인데, 이는 나중에 PDMS에서 이 구조를 분리하는 데 도움이 될 것입니다. 그래서 우리는 칩을 이 건조제에 넣고, 이 트라이 클로로 실링(tri Chloro Siling)의 몇 방울을 건조제에 몇 방울 떨어뜨릴 것입니다.

우리는 후드 내부에서 이것을 하는데, 이것은 매우 가혹한 수소 염산 가스의 부산물을 가지고 있기 때문입니다. 계속해서 뚜껑을 닫고 이것을 진공 청소기에 부착한 다음 진공 상태에서 이것을 그대로 두고 밤새 이 침전물을 두어 전체 실리콘 웨이퍼에 멋진 코팅을 얻습니다. 안녕하세요, 저는 웨슬리 리건입니다.

저는 크리스토퍼 첸(Christopher Chen)의 연구실에 재학 중인 대학원생입니다. 이 시점에서 Nate는 ED 기판용 실리콘 마스터를 만드는 방법을 보여주었습니다. 그러나 이 도구를 사용하여 세포 수축성을 측정하기 전에 먼저 엘라스토머 실리콘 폴리머를 사용하여 단단한 사진 구조를 복제해야 합니다.

우리의 첫 번째 작업은 이전에 제작한 실리콘 마스터의 네거티브 템플릿을 생성하는 것입니다. 우리는 PDMS 폴리머에 PDMS 또는 Polymethyl Sloane이라는 실리콘 엘라스토머를 사용하여 이 작업을 수행합니다. 이제 경화제를 1:10 비율로 추가합니다.

용액의 무게를 측정한 후에는 PDMS 폴리머와 교차 누출제를 완전히 혼합해야 합니다. 이 혼합은 분명히 솔루션에 많은 기포를 도입합니다. 따라서 이 시점에서 덮개를 제거하고 진공 건조제에서 가스를 제거해야 합니다.

PDMS가 완전히 탈기되고 모든 기포가 표면으로 올라와 터지면 진공 건조제에서 제거할 수 있습니다. 이제 PDMS와 가교제의 혼합물을 사용하여 실리콘 마스터의 네거티브 몰드를 생성할 수 있습니다. 이를 위해 파이 깡통을 사용하고 장착된 실리콘 마스터를 그 중앙에 놓습니다.

그런 다음 DGAs 폴리머 용액을 실리콘 웨이퍼 상단의 접시에 조심스럽게 부어 추가 기포가 형성되는 것을 방지합니다. 일반적으로 우리는 약 1/4 인치 두께의 폴리머를 붓습니다. 이 과정에서 필연적으로 혼합물에 약간의 기포가 유입되는 것을 볼 수 있습니다.

이제 우리는 거품이 표면으로 올라와 터질 수 있도록 이 접시를 약 30분 동안 따로 둡니다. 그대로 두면 PDMS 표면에 여전히 약간의 기포가 있음을 알 수 있습니다. 그러나 이것들은 상단 표면에 있기 때문에 이제 질소를 빠르게 분사하여 남아 있는 거품을 터뜨릴 수 있습니다.

PDMS 및 CROSSLINKER 솔루션을 완전히 가교결합하고 실리콘 마스터의 견고한 네거티브 템플릿을 생성하기 위해 섭씨 110도에서 20분 동안 베이킹합니다. 실리콘 기판 위에 PDMS의 얇은 층이 있음을 알 수 있습니다. 그리고 두 개를 떼어내기 전에 먼저 이 층을 잘라내야 합니다.

그런 다음 이 최상층을 접목하고 실리콘 기판에서 부드럽게 벗겨낼 수 있습니다. 이 시점에서 우리는 네거티브 실리콘 기판, 즉 네거티브 PDMS 기판을 실리콘 마스터에서 반전시키고 매우 천천히 벗겨낼 수 있습니다. 자, 한쪽 끝을 잡고 PDMS 기판을 부드럽게 벗겨내면 됩니다.

기판이 실리콘 마스터에서 벗겨짐에 따라 전면이 진행되는 것을 볼 수 있습니다. 이제 실리콘 마스터의 A-P-D-M-S 네거티브 몰드를 생성했으므로 이를 4개의 개별 네거티브 몰드로 절단하여 최종 패드 기판을 만들 수 있습니다. 이 시점에서 표면이 손상되지 않도록 집게나 장갑으로 음극 기판 상단을 만지지 않는 것이 중요합니다.

그래서 이 시점에서, 우리는 9미크론 깊이의 3미크론 직경의 웰로 구성된 실리콘 마스터에서 4개의 개별 네거티브 템플릿을 생성했습니다. 융기된 캔틸레버 표면을 재생하기 위해 PDMS를 사용하는 PDI PDMS에서 이러한 네거티브 몰드에 다시 주조할 수 있습니다. 그러나 그렇게 하기 전에 먼저 불소로 코팅하여 이러한 네거티브 몰드를 비접착식으로 만들어야 합니다.

우리는 100와트 플라즈마 챔버에서 1분 동안 최대 전력으로 이 작업을 수행합니다. 챔버가 플라즈마의 회수율을 펌핑 다운하도록 한 후, PDMS 상단 표면을 에칭하고 플루오로 Cy Lane 분자에 더 접착력을 부여하는 이온 가스장을 생성합니다. 진공 건조제에서 네거티브 몰드를 제거한 후 여기에서 남은 것은 비접착 PDMS 층에 3미크론 x 10미크론 깊이의 웰 어레이인 것을 볼 수 있습니다.

mpad 기판에 사용하는 수직 캔틸레버를 재생하려면 동일한 PDMS 혼합물을 사용하여 이를 다시 캐스팅해야 하며, 이렇게 하면 이전에 제작한 실리콘 마스터를 동일하게 미러링하는 엘라스토머 캔틸레버의 포지티브 독립형 어레이를 남길 수 있습니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 비접착 네거티브 몰드를 PDMS 스트립과 유리 현미경 슬라이드로 만든 마운팅 지그로 옮기는 것입니다. 이 리그의 이유는 다음 단계에서 명확해질 것입니다.

이 시점에서, 우리는 이미 가스를 제거한 가교제에 대한 PDMS의 동일한 10:1 혼합물의 작은 방울을 각 네거티브 몰드의 상단 표면에 증착할 수 있습니다. 소량의 PDMS만 필요하므로 네거티브 몰드의 가장자리로 연결되지 않습니다. 이 시점에서.

금형의 상단 표면에 PDMS를 보다 완전히 퍼뜨리기 위해 집게를 사용하여 하나를 잡고 뒤집은 다음 PDMS 주위에 조심스럽게 펼쳐진 인접한 금형과 접촉시켜 전체 기판을 완전히 덮을 수 있습니다. 이 단계에서 PDMS 용액이 다른 두 개의 웰, 다른 두 개의 금형으로 반복될 수 있는 상단 PDMS 용액에 추가 기포를 도입하지 않도록 매우 주의하십시오. 이제 상단 표면에 걸쳐 보다 균일한 PDMS 코팅이 적용되었으므로 이 지그를 진공 건조제에 배치하여 네거티브 몰드 상단의 PDMS 필름에 갇힐 수 있는 기포를 추가로 제거할 수 있습니다.

이 프로세스는 일반적으로 약 30분 정도 걸립니다. 네거티브 몰드가 가스를 제거하는 동안 패드의 최종 장착 장소가 될 22 x 22mm 유리 기판을 청소할 수 있습니다. 이 공정의 첫 번째 단계는 압축 질소를 사용하여 먼지 입자를 불어내는 것입니다.

유리 커버 슬립을 가스 플라즈마에 노출시켜 표면을 재로 만들고 PMS에 더 접착력을 높인 다음 다음 단계에서 이를 고수할 것입니다. 약 30분 동안 PDMS의 최상층을 DGA에 허용하고 플라즈마로 유리 커버 슬립을 활성화한 후, 템플릿을 제거하고 가스 플라즈마에 노출된 유리 커버 슬립의 상단 표면을 네거티브 몰드 상단의 PDMS 층과 접촉시킬 수 있습니다. 일반적으로 유리 커버 슬립의 한쪽 가장자리를 PDMS와 먼저 접촉시킨 다음 나머지 유리 커버 슬립을 SH에 고정시켜 PDMS가 시트와 같은 방식으로 퍼지도록 하는 데 도움이 됩니다.

이는 PDMS 필름에 유입되는 기포를 줄이는 데 도움이 됩니다. 이 시점에서 집게로 유리 커버 슬립의 상단 표면을 부드럽게 눌러 여분의 PDMS를 밀어낼 수 있을 뿐만 아니라 커버 슬립을 템플릿 중앙의 PDMS 십자가에 대고 살짝 밀어 올릴 수 있습니다. 이렇게 하면 PDMS가 경화되는 동안 커버 슬립이 움직이는 것을 방지할 수 있습니다.

다른 기판에 대해서도 이 작업을 반복합니다. 이 시점에서 전체 템플릿을 오븐으로 옮기고 섭씨 110도에서 22시간 동안 구울 수 있습니다. 전체 어셈블리를 실온으로 냉각시킨 후 기판을 제거하고 뒤집은 다음 유리 커버 슬립에서 음극 금형을 조심스럽게 벗겨낼 수 있습니다.

포스트가 부서지거나 유리 기판에서 찢어지는 것을 방지하기 위해 이 작업을 천천히 균일하게 수행하는 것이 중요합니다. 우리는 네거티브 몰드를 벗겨낸 후 실리콘 마스터를 정확하게 모방한 캔틸레버 배열이 남았음을 알 수 있으며, 이제 그것들은 유연한 PDMS 엘라스토머로 구성되었음을 알 수 있습니다. 자, 이제 Emad 기판의 Silicon Master를 생성하는 방법을 안내해 드렸습니다.

그런 다음 복제 성형 공정을 사용하여 A-P-D-M-S 엘라스토머 폴리머를 사용하여 정확한 복제본을 생성함으로써 캔틸레버가 유연해져서 그 과정에서 셀이 퍼지고 수축하고 편향될 수 있도록 했습니다. 이 시점에서 당사의 기질은 세포 배양을 위해 처리할 준비가 되었습니다. 이제 EDS를 만들기 위해 금형을 제작하고 복제하는 방법을 살펴보았으므로 EDS가 작동하도록 하여 직접 배양하고 이후에 견인력을 분석할 수 있도록 몇 가지 단계를 더 수행할 것입니다.

하지만 그 전에 세 가지를 해야 합니다. 기둥의 끝을 세포에 접착해야 합니다. 둘째, 포스트 편향의 시각화 및 분석을 돕기 위해 PDMS에 형광 라벨을 지정해야 합니다.

셋째, 기둥의 측벽과 기둥의 바닥을 셀에 접착되지 않게 만들어 기둥 끝에서만 견인력이 가해지도록 해야 합니다. 따라서 다음 몇 분 동안 마이크로 접촉 인쇄 기반 전략을 통해 이러한 단계가 어떻게 진행되는지 살펴보겠습니다. 그러나 먼저 다음 단계는 eds에서 과도한 P-D-S-P-D-M-S를 청소하는 것입니다.

아까 말씀드렸듯이 첫 번째 단계는 West가 방금 보여준 EDS 기판을 생성하고 자르는 것입니다. 유리 커버를 경화하여 발생한 과도한 PDMS는 네거티브 몰드에 미끄러지고 날카로운 면도날 트림을 사용합니다. 과도한 PDMS는 면도날을 기둥 가장자리의 기판에 수직으로 내려 놓고 긁어내어 이 작업을 수행합니다.

그리고 한 손가락으로 커버 슬립을 제자리에 고정하여 커버 슬립이 움직이지 않도록 할 수 있습니다. 그래서 우리가 갖게 된 것은 파편으로 청소되어 쉽게 접근할 수 있는 M 패드 기판입니다. 따라서 다음 단계에서는 마이크로 접촉하고 MPA를 인쇄하여 기둥 끝을 접착해야 합니다.

이렇게하려면 먼저 우표를 생성해야하며이 과정은 매우 쉽습니다. 우리는 10:1 비율, 1:30 대 1 비율 대신 PDMS를 혼합하기만 하면 됩니다. PDMS 높이가 약 1cm가 되도록 페트리 접시를 붓습니다.

가스를 제거하자. 즉, 거품이 PDMS의 상단으로 올라오도록 하고 오븐에서 접시를 꺼내 식힌 후 60도의 오븐에서 1시간 동안 가교 반응을 치료하면 이제 스탬프를 잘라낼 준비가 되었습니다. 따라서 다시 같은 종류의 면도날을 사용하여 페트리 접시 바닥에 닿을 때까지 PDMS에 수직으로 아래쪽으로 눌러 절단하기만 하면 됩니다.

이제 우표의 방향은 우리가주의를 기울이고 싶은 것입니다. 스탬프 표면은 페트리 접시의 바닥에 주조된 PDMS의 측면이 되어 평평하게 유지됩니다. 제가 잘라낸 PDMS의 큰 사각형에서 스탬프 표면은 이제 앞면이 위로 향하게 되어 있습니다.

자,이 스탬프는 M 패드보다 훨씬 크기 때문에 면도날로 잘라서 다시 단일 M 패드 크기로 트리밍 할 예정인데, 스탬프의 정확한 방향을 눈으로 말하기가 매우 어렵 기 때문에 스탬프의 뒷면이 될 부분에 약간의 노치를 넣을 것입니다. 그런 다음 더 큰 슬래브에서 스탬프를 제거할 수 있습니다. 그리고 이제 다음 단계를 위한 A-P-D-M-S 스탬프가 있습니다.

PDMS 스탬프를 정리하고 싶습니다. 내가 PDMS 스탬프를 자르는 동안 대기의 먼지가 PDMS 스탬프에 가라앉았을 가능성이 매우 높기 때문입니다. 이것은 이 결정화 접시에 원하는 수의 PDMS 스탬프를 넣고 결정화 접시 접시에 100% 에탄올을 채우는 과정입니다.

따라서 우표의 표면을 덮을 만큼 충분한 에탄올을 추가하기만 하면 되지만 첨가된 에탄올의 정확한 양은 중요하지 않습니다. 그런 다음 결정화 디스크를 에이터에 넣고 스탬프를 5 분 동안 초음파 처리합니다. 5분이 지나면 스탬프 살균을 완료하고 멸균 조직 배양 후드에서 M 패드의 기능화인 나머지 마이크로 접촉 인쇄를 수행합니다.

이제 우리는 우표의 살균을 마칠 수 있는 조직 배양 후드에 있습니다. 이를 위해 결정화 접시에서 스탬프를 가져와 에탄올이 가득 찬 접시에 담궈 남은 찌꺼기를 헹구고 마지막으로 물 접시에 담가 에탄올을 헹굽니다. 그런 다음 질소 흐름으로 더 이상 눈에 띄는 방울이 남지 않을 때까지 스탬프를 건조시킵니다.

따라서 다음 단계에서는 단백질 용액으로 스탬프에 잉크를 칠해야 합니다. 우리가 사용하는 단백질 용액은 DEI 물에 있는 피브린 mil당 50마이크로그램입니다. 단백질 용액의 일부를 피펫에 넣고 단백질 용액 방울을 스탬프 표면에 떨어뜨리기만 하면 됩니다.

스탬프 면의 가장자리에 작은 물방울을 배치하여 이 작업을 수행하려고 합니다. 먼저 사용할 모든 스탬프에 대해 이 작업을 반복하고 미리 이 작업을 수행했어야 했습니다. 따라서 모든 스탬프의 가장자리에 점을 배치한 후 다음 단계는 해당 방울을 연결하고 스탬프 면에 단백질 용액을 채우는 것입니다.

우리가 이렇게 한 이유는 물방울의 단백질 용액과 물방울 아래의 sos가 스탬프 표면을 친수성으로 만들어 세포외 기질 단백질을 더 쉽게 퍼뜨릴 수 있기 때문입니다. 다시 말하지만, 우리가 우표의 표면에 단백질 용액을 펴 바르고 우표에 잉크를 칠하는 마지막 단계는 가장자리가 덮여 있는지 확인하는 것입니다. 이를 위해 피펫의 각도를 조정하고 스탬프 면을 따라 실행하여 PDMS 스탬프의 모서리와 단백질 용액 모두에 접촉하도록 합니다.

그리고 다시, 잉크를 칠하는 모든 스탬프의 모든 가장자리에 대해이 작업을 반복하십시오. 이제 스탬프에 잉크를 칠하는 것을 마쳤으므로 해당 스탬프를 설정하고 단백질이 스탬프 표면에 완전히 흡수될 수 있도록 조직 배양 후드에 스탬프를 한 시간 동안 그대로 둡니다. 단백질이 저장고로 들어가 스탬프 표면에 흡수될 때까지 한 시간을 기다렸으니 이제 단백질을 물로 헹구고 질소로 건조시킬 차례입니다.

이렇게하기 위해 멸균 된 물을 취하여 우표가 들어있는 접시에 멸균 된 물을 붓습니다. 스탬프 표면에 물을 직접 붓지 않도록 주의하고 필요한 경우 피펫을 사용할 수 있습니다. 당신이 가지고 있던 물의 정확한 양은 물의 수준을 단백질 용액 위로 가져오는 한 중요하지 않습니다.

그 후, 멸균 핀셋으로 스탬프 하나를 가져 와서 새 물 접시에 담그고 질소로 부드럽게 말리십시오. 다시 말하지만, 당신은 당신이 볼 때, 당신이 더 이상 우표에 단백질 용액 방울을 볼 수 없을 때 그것이 건조하다는 것을 알게 될 것입니다. 그리고 한 번에 하나씩 처리하는 모든 스탬프에 대해 이 작업을 반복합니다.

이제 스탬프를 건조하게 헹궈 냈으므로 UV 오존으로 처리하여 mpad 기질을 활성화 할 때입니다. 7분 동안 접시 위쪽에서 페트리 접시 뚜껑을 제거합니다. 폴리스티렌은 자외선을 흡수하기 때문에 접시를 자외선 오존 처리기에 넣고 서랍을 닫고 시간을 7 분으로 설정하고 놓아줍니다.

이제 우리는 조직 배양 후드로 돌아왔고 UV 오존으로 처리된 mpad 기질에 스탬핑을 할 때입니다. 이렇게하려면 헹구고 말린 우표를 집게로 들어 올리십시오. 우표는 측면에서 처리 할 수 있지만 우표의 앞면은 만지지 마십시오.

단백질 쪽에 접근할 수 있도록 겸자의 스탬프를 조정하려고 합니다. 그런 다음 단백질 쪽이 아래를 기반으로 한다는 것을 염두에 두고 집게를 뒤집고 천천히 스탬프를 eds와 접촉시킵니다. 1개에서 30개의 스탬프는 꽤 끈적거리기 때문에 집게에서 스탬프를 분리하기 위해 두 번째 핀셋을 사용해야 할 수도 있습니다.

스탬프를 약 2mm 높이에서 약 8mm 높이로 emeds에 떨어 뜨릴 수 있습니다. 그런 다음 emeds의 접시를 위로 기울이고 우표와 eds 사이에 접촉을 만들기 위해 집게로 부드럽게 누릅니다. 두 가지 방법 중 하나로 연락이 이루어지면 알 수 있습니다.

첫 번째는 스탬프 측면을 통해 ED 표면을 보는 것입니다. 카메라에서는 보기 어려울 수 있지만 눈으로 보면 우표의 측면을 통해 표면을 보면 우표가 표면과 접촉하고 있음을 분명히 알 수 있습니다. 접촉을 확인하는 두 번째 방법은 뚜껑을 씌운 상태에서 조직 배양 후드에서 페트리 접시를 꺼내 도립 현미경으로 보는 것입니다.

현미경으로 간섭 패턴을 시각화하면 스탬프가 eds와 접촉하는 경우, 언제 접촉하는지 알 수 있어야 합니다. 접촉을 결정하면 스탬프는 몇 초 동안 ed 기판과 접촉을 유지하기만 하면 됩니다. 이제 스탬프를 제거할 때입니다.

이렇게하려면 핀셋 한 쌍으로 Eds를 접고 한 번의 부드러운 동작으로 스탬프를 벗겨냅니다. 어떤 eds에 스탬프를 찍었는지, 그리고 이전에 이미 사용한 스탬프를 추적하십시오. 그리고 사용하려는 모든 기판에 대해 EMPA당 한 번씩 이 절차를 반복합니다.

이제 EMPA에 스탬프를 찍었으므로 다음 단계는 EMPA를 살균한 다음 dye eye라고 하는 친유성 염료로 배양하는 것입니다. Dai는 형광 태그가 지정된 친유성 분자이므로 시간이 지남에 따라 PDMS로 확산되어 현미경으로 포스트 편향을 시각화할 수 있습니다. 그래서 제가 할 일은 각 개별 엠파 기판을 한 번에 하나씩 가져 와서 100 % 에탄올, 70 % 에탄올, DI 물, DI 물, DI 물, DI 물에 담그는 것입니다.

그리고 마지막으로, dii의 mil 당 5 마이크로 그램 용액. DII 용액은 형광성이므로 주변광에 대한 노출을 최소화하고 광 표백을 최소화하기 위해 접시가 조직 배양 후드에서 1시간 동안 배양하는 동안 알루미늄 호일로 접시를 덮습니다. 이제 EM 패드가 DAI 용액에서 배양될 때까지 1시간을 기다렸으므로 알루미늄 호일을 제거하고 DAI 용액을 헹굴 수 있습니다.

우리는 살균 된 물에 세 번 순차적으로 담그고 마지막으로 0.2 % onic F1 27의 용액에 담그십시오. 부피당 0.2%의 무게입니다 모든 침수 단계에서 EM 패드가 공기에 노출되는 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. 이는 ED 기판의 손상을 방지하고 특히 두 개의 포스트가 서로 무너지는 것을 방지하기 위한 것입니다.

0.2%onic F1 27은 친수성 및 소수성 도메인으로 구성된 트라이 블록 공중합체입니다. 친수성 도메인은 단백질 흡수에 저항하여 세포 접착에 저항하는 것으로 알려져 있는 반면, 소수성 도메인은 소수성 PDMS에 템퍼와 결합합니다. 따라서, PDMS가 F1(27)에 담가졌을 때, F1(27)은 PDMS에 결합하고 세포 부착을 반발한다.

알루미늄 호일로 덮인 페트리 접시에서 만성 F1 27에서 1 시간 동안 배양 한 후 멸균 수, 멸균 수 및 PBS에 순차적으로 담그면 F1 27을 헹굴 수 있습니다. PBS에 담그고 제품 F1 27을 헹궈낸 후, 기질을 선택한 세포 배양 용액에 담글 수 있습니다. 방금 EMPA를 담근 세포 배양 용액에는 혈청 및/또는 기타 성장 인자 및/또는 페니실린 및 스트렙토마이신과 같은 보충제가 포함될 수 있습니다.

이러한 모든 성분은 EMPA 트리트먼트와 완벽하게 호환됩니다. 이제 eds가 세포 배양 용액에 침지되면 다음 단계는 선택한 세포를 eds에 시딩하는 것입니다. 이 특별한 실험 설정을 위해 저는 소 폐 대동맥 내피 세포를 세 가지 다른 접시에 파종할 것입니다.

내가 세 가지 다른 요리를 사용하는 이유는 나중에 분석할 수 있도록 게시물의 편향을 억제하기 위해 알려진 촉감 억제제로 두 가지 요리를 처리할 것이기 때문입니다. 따라서 세포를 씨를 뿌리기 위해 세포 현탁액을 가져 와서 적절한 양을 피펫에 넣고 각 접시에 피펫을 적게합니다. 견인력을 측정하기 위해 분석을 수행할 때 세포가 eds에 단일 세포 세포로 존재하도록 충분한 세포를 추가합니다.

추가하는 양은 확산 영역과 특정 세포의 성장 속도에 따라 달라집니다. 우리는 일반적으로 1500에서 5, 기질의 센티미터 제곱 당 000 세포 사이를 파종합니다. 세포를 파종하거나 세포 현탁액을 편집한 후, 배양액을 직교 방향으로 여러 번 부드럽게 앞뒤로 떨어뜨려 세포 현탁액을 배양 접시에 혼합합니다.

사용 중인 모든 기판에 대해 이 과정을 반복합니다. 세포를 파종한 직후, pH와 세포 배양 배지를 완충하기 위해 적절한 수준의 이산화탄소가 있는 37도 인큐베이터에 넣습니다. 세포를 파종한 후 약 2시간 후인 2시간 후, 한 접시의 배지에서 동일한 세포 배양 배지의 새 접시로 기질을 옮겨 세포를 헹구는 것이 적절합니다.

이렇게 헹구는 이유는 대부분의 세포가 퍼지기 시작하고 2시간 내에 거의 최종 확산 영역에 도달하기 때문입니다. 세포, 기질을 헹구면 세포 배양 배지에서 부유 세포를 제거할 수 있습니다. 이렇게 하면 EDS에 부착되어 확산 과정을 시작하는 세포만 견인력에 대한 종말점 분석에 표시됩니다.

MPA에서 배양된 세포로 수행할 수 있는 한 가지 분석은 세포 수축성의 역학을 정량적으로 조사하기 위한 타임 랩스 이미징입니다. 특히, 용해성 요인에 반응하는 세포 수축성의 역학은 흥미롭습니다. 생물학적 화합물 및 합성 화합물과 같은 용해성 인자는 세포 수축성을 증가, 감소 또는 알려지지 않은 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다.

이 라이브 셀 실험을 위해 이 도립 에피 형광 현미경을 사용할 것입니다. 현미경 무대에서 저는 작은 인큐베이터 상자를 열 조절기에 연결하여 온도를 섭씨 37도에서 5%CO2로 유지합니다. 우리는 60배 계획 APO 대물렌즈로 고배율로 이미징할 것입니다.

이제 이미징을 위해 충격 기판을 준비하러 갈 것입니다. 이미징에 사용하는 60 x 대물렌즈의 작동 거리는 200미크론이며, 이는 이전에 세포를 파종한 조직 배양 접시의 두께보다 훨씬 얇습니다. 그러므로, 우리는 조직 배양 접시에 있는 임플란트의 세포를 이미지화할 수 없습니다.

이 문제를 해결하기 위해 우리는 이러한 유리 바닥 접시를 사용합니다. 이제 기판을 유리 바닥 접시에 거꾸로 옮겨 셀과 기둥 끝이 유리 바닥 접시의 계면에 있도록 합니다. 따라서 이를 현미경에 놓으면 세포와 대물렌즈 사이의 작동 거리가 200미크론 미만이 됩니다.

이제 이미징을 위해 현미경에 적용할 준비가 되었습니다. 이제 라이브 셀 인큐베이터 챔버를 열고 샘플을 내부에 넣은 다음 인큐베이터 챔버 뚜껑을 교체합니다. 이 시점에서 기질에서 적절한 세포를 스캔합니다.

이미지로. 이를 수행하는 가장 효율적인 방법은 Face Phase One 10 x objective를 사용하는 것인데, 이를 통해 기판의 더 넓은 시야를 보고 세포를 더 빨리 찾을 수 있습니다. 좋은 세포에 대한 나의 기준은 단일 세포에 대한 것입니다.

그것은 이웃 세포에 닿아서는 안되며, 또한 기질의 다른 모든 세포에 비해 크기가 평균 정도여야하며, 볼 수있는 적절한 세포를 찾았습니다. 다음으로 할 일은 대물렌즈를 60배로 전환하여 고배율로 셀을 보는 것입니다. 이를 위해 목표의 초점을 흐리게 하여 회전 중에 스테이지에 부딪히지 않도록 합니다.

포탑을 회전하는 동안 챔버를 열고 60 x 대물렌즈 인터뷰 60 x 60 x 대물렌즈를 부분적으로 회전합니다. 대물렌즈는 오일 이멀젼 렌즈이므로 대물렌즈에 이멀젼 오일 한 방울을 떨어뜨려야 합니다. 이제 터트를 회전하여 60 x를 제자리로 가져옵니다. 인큐베이터 챔버를 닫고 대물렌즈의 초점을 다시 맞춰 세포에 다시 초점을 맞춥니다.

세포의 위치와 초점을 미세 조정한 후에는 CCD 카메라로 전환하여 컴퓨터 화면에서 세포를 미리 본 다음 타임랩스 이미징을 시작합니다. 이 실험에서는 1분 간격으로 위상 이미지와 형광 이미지를 모두 수집하여 타임 랩스 이미징이 시작되고 10분 또는 10프레임 동안 실행된 다음 그 시점에서 10분이 경과한 혈청을 추가합니다. 이때 챔버를 열고 접시에 세럼을 첨가하여 세포의 수축을 자극합니다.

타이머가 계속 작동하고 있으니 이 작업을 빨리 해야 합니다 이제 수축성의 변화를 추적하기 위해 30분 동안 셀을 계속 이미징할 것입니다. 타임랩스 이미징을 마친 후 이미지를 상영된 동영상으로 시퀀싱할 수 있습니다. 다음은 위상 및 형광 이미지의 두 가지 동영상입니다.

왼쪽에는 검은색 윤곽선으로 표시된 대부분 투명한 셀의 위상 동영상이 있습니다. 세포는 직사각형 격자로 배열된 원형 구조인 20개의 기둥 끝에 걸쳐 퍼져 있습니다. 오른쪽에는 같은 세포의 형광 영화가 있지만 게시물만 보입니다.

이 동영상을 재생하면 셀에 부착된 포스트가 처음에는 약하고, def 편향되며, 직사각형 격자에서 거의 벗어나지 않는 것을 볼 수 있습니다. 영화 중반쯤에, 나는 미디어에 세럼을 넣었다. 혈청은 세포를 자극하여 수축성을 증가시킵니다.

세포가 밑에 있는 기둥에 더 큰 견인력을 가함에 따라, 세포 둘레를 따라 있는 기둥이 안쪽으로 편향되기 시작합니다. 형광 영화에서는 이제 게시물이 직사각형 격자의 위치에서 크게 벗어나는 것을 볼 수 있습니다. 나중에 설명하겠지만, 이 이미지에서 이러한 포스트 위치의 변위는 이 세포의 견인력을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

이전에는 mpad 기질을 생성하는 방법과 세포를 배양하기 위해 이를 기능화하는 방법을 살펴보았습니다. 이제 완성된 mpad 기질을 세 개의 다른 세포 배양 접시에 배치한 것을 눈치채셨을 것입니다. 세포는 하룻밤 사이에 성장해 왔고, 이제 제가 할 일은 알려진 방식으로 수축성을 조절하는 다른 용해성 물질로 각 개별 세포 배양 접시를 처리하는 것입니다.

그런 다음 세포를 30분 동안 고정한 후 발생하는 견인력을 정량적으로 측정할 수 있습니다. 수축성 억제제를 첨가한 후 30분 후에 용해성 인자를 첨가한 후, 이제 파라폼 알데히드로 세포를 고정하여 견인력의 현재 상태를 고정할 때입니다. 이를 위해서는 칼슘과 마그네슘을 함유 한 파라 폼 알데히드를 사용하는 것이 중요하며, 파라 폼 알데히드를 3.7 %의 부피 비율로 사용합니다.파라 폼 알데히드에 기판을 담그는 방법은 죄송하지만, 기능화 중에 다른 RIN에 기판을 담그는 방법과 동일합니다.

즉, 기판이 건조되지 않도록 하는 것이 중요하며, 이는 붕괴 후 이어질 수 있습니다. 내가 옮긴 후, 나는 기질을 옮겼고, 나는 그들이 파라 폼 알데히드에서 20 분 동안 배양하도록했다. 20분이 지나면 파라폼 알데히드에서 기질을 제거하고 이제 세포가 고정되었으므로 표준 면역 염색을 위해 이러한 샘플을 처리할 수 있습니다.

이를 위해 기판을 param에 위로 향하게 놓고 피펫을 충분한 PBS에 배치하여 기판을 덮고 PBS 아래에 유지합니다. 그런 다음 PBS로 기질을 세 번 헹구어 배양물에 남아 있을 수 있는 파라폼 알데히드를 제거합니다. PBS로 기질을 세 번 헹구면 다운스트림 면역 염색을 위해 기질을 옮길 수 있습니다.

우리는 한 쌍의 핀셋으로 기질을 처리하고 면역 염색의 첫 번째 단계에서 반전을 통해 이를 수행하는데, 이것이 투과제입니다. 이 경우 PBS에서 0.2%Triton X를 사용하고 있습니다. 그러나 사용자는 자신의 필요에 가장 적합한 화제를 사용할 수 있습니다.

우리는 모든 기질에 대해 이것을 반복하며 이것이 면역 염색 공정 중에 기질을 처리하는 방법입니다. 면역 염색 후 기판을 표준 1인치 x 3인치 유리 슬라이드에 장착한 다음 도립 또는 직립형에 관계없이 모든 에피 형광 현미경에서 처리할 수 있습니다. 컨포칼 현미경에서 샘플을 처리함으로써 기둥의 바닥에 초점을 맞춰 null 위치인 un f편향을 얻을 수 있습니다.

그런 다음 기둥의 끝까지 초점을 맞추고, 기둥의 다른 이미지를 찍고, 위쪽 이미지와 아래쪽 이미지를 비교하여 기둥의 편향을 측정하고 세포가 그러한 편향을 생성하기 위해 생성한 세포의 견인력을 계산할 수 있습니다. 여러 다른 조건에서 많은 다른 세포에 대해 이 과정을 수행함으로써 다른 조건에서 생성된 견인력을 비교할 수 있습니다. 이제 우리는 살아있는 세포와 고정된 세포의 이미지를 모두 수집했으므로 다음 작업은 편향을 측정하고 세포의 견인력을 측정하는 것입니다.

이를 위해, 이를 위해 우리는 matlab에서 컴퓨터 프로그램을 작성했습니다. 이 분석에서 사용할 세 가지 이미지입니다. 그리고, 제1 이미지는 세포의 위상 이미지이다.

세포의 위치를 식별하는 데 도움이 됩니다. 두 번째 이미지는 게시물 상단의 형광 이미지입니다. 우리는 이 이미지를 사용하여 팁에 있는 게시물의 위치를 찾습니다.

보시다시피, 이러한 게시물 중 일부는 이 게시물과 같이 대부분의 게시물이 있는 직사각형 격자에서 편향되고 벗어납니다. 그리고 이 게시물. 우리가 사용할 세 번째 이미지는 기본 이미지로, 베이스를 가로지르는 초점면에서 기둥의 위치를 캡처합니다.

이 수준에서, 편향된 포스트와 편향되지 않은 포스트는 모두 그들의 정지 위치, un, un 편향된 위치에 위치해야 합니다. 직사각형 격자에서 두 번째 이미지에서 기저부의 편향된 기둥이 FL 위치에 있는 것을 볼 수 있습니다. 이 이미지는 포스트의 위치를 찾는 데 사용되며, 반사된 위치 아래에 있습니다.

다음으로 MATLAB 프로그램을 로드하면 이 세 개의 이미지를 로드하라는 메시지가 표시됩니다. 파일 이름을 지정합니다. 위상 이미지가 표시됩니다.

셀이 있는 위치를 나타내는 상자 주위에 상자를 그려 프로그램이 분석할 게시물을 알 수 있도록 합니다. 그런 다음 프로그램은 게시물의 OID 좌표를 결정하기 위해 자른 이미지의 강도, 임계값 및 화를 수행합니다. 왼쪽은 상단 이미지에서 게시물의 이미지화한 이미지이고 오른쪽은 기본 이미지에서 동일한 게시물의 이미지화된 이미지입니다.

포스트, OID 좌표를 얻은 후 프로그램은 각 포스트의 팁과 베이스 사이의 변위 벡터를 결정할 수 있습니다. 이러한 포스트 디스플레이스먼트 벡터는 포스트의 스프링 상수를 곱하여 힘 벡터로 변환할 수 있습니다. 우리는 세포당 평균 힘 또는 포스트당 평균 힘과 같은 여러 가지 방법으로 이러한 세포의 힘을 분석할 수 있습니다.

한 가지 유용한 결과는 힘의 공간적 분포를 시각화할 수 있는 퀴버 플롯입니다. 이것은 우리가 방금 분석한 세포이며 힘의 크기와 상관 관계가 있고 힘의 방향을 가리키는 기둥에 노란색 화살표를 겹쳐 놓은 것을 볼 수 있습니다. 타임랩스 무비에 필요한 것과 같은 시퀀스 이미지에 대해 이 이미지 분석 프로세스를 반복하면 시간 시퀀스를 생성할 수 있습니다.

다음은 우리가 혈청으로 자극한 세포의 영상입니다. 보시다시피, 혈청이 첨가되자마자 세포는 수축성을 증가시키고 포스트를 훨씬 더 편향시켰습니다. 또한, 우리는 대조 화합물로 처리된 세포와 수축성 억제제로 처리된 세포를 보여주는 이러한 떨림 그래프에서 예시된 것처럼 서로 다른 조건에 노출된 다음 고정 염색된 더 많은 수의 세포에 대한 힘을 정량화할 수 있습니다.

당신이 할 수 있듯이. 보시다시피, 제어 케이스의 셀에 있는 힘 벡터는 힘 벡터보다 크기가 큰 것보다 큽니다. 수축성 억제제가 사용된 두 가지 경우에서, 우리는 이러한 기질의 다재다능한 다양성을 입증하기 위해 마이크로 제조에서 시료 준비, 실험 및 분석에 이르는 경로 기판을 설명하기 위해 여기에서 많은 재료 재료를 다루었습니다.

우리는 두 가지 다른 분석, 즉 라이브 셀 이미징(live cell imaging)과 고정 샘플 분석(fixed sample assay)에 대해 설명했으며, 이 두 가지 분석에서 얻은 세포를 분석하고 떨림 플롯과 떨림 필름을 보여주었습니다. 이 강력한 도구를 사용하면 세포 수축성에 대한 다양한 공간 및 시간 분석을 수행할 수 있습니다. 보시다시피 이 방법은 마이크로 제조, 기본 세포 생물학, 표면 과학, 이미지 분석 및 처리 등 다양한 분야를 활용했습니다.

그리고 그 방법은 여러 가지 다른 엔지니어링 기술에 기반을 두고 있기 때문에 포스트 형상, 유도된 용해성 요인 및 포스트 편향을 분석하는 방법과 같은 매개변수를 사용자의 필요에 따라 사용자 정의할 수 있습니다. 지난 20, 30분 동안 개략적으로 설명한 이 방법의 시각적 시연이 세포 인력의 조절, 기능적 결과 및 생성에 대한 다른 심층 분석의 출발점으로 사용될 수 있기를 바랍니다.