인간 유도 만능의 줄기 세포를 Transfecting 및 Nucleofecting

본 실험의 전반적인 목적은 최적화된 transfection 및 nuclear affection 프로토콜을 사용하여 인간 유도만능줄기세포에서 높은 transfection 효율을 달성하는 것입니다. 이는 먼저 인간 유도만능줄기세포의 feeder-free 배양법을 확립함으로써 수행됩니다. transfection을 위해, 인간 유도만능줄기세포를 gelt, TRX 또는 matrigel 위에 하룻밤 동안 도말합니다.

핵 transfection을 위해 trypsin으로 소형 세포 클러스터를 얻은 후, plasmid DNA와 gene juice transfection 시약 혼합물을 플레이팅된 세포에 첨가하고, 플레이트를 원심 분리한 뒤 37°C에서 배양합니다. 인간 iPS 세포 현탁액을 transfection 장치에서 transfection 처리하고, 세포를 meth 조건 배지로 재현탁하여 37°C에서 배양합니다. 최종적으로 인간 iPS 세포에서 높은 transfection 효율을 통해 효율적인 유전자 조작이 이루어진 결과를 얻을 수 있습니다.

이전에 설명된 transfection electroporation 및 nuclear affection 방법과 같은 기존 방법들과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 우리 실험실에서 일관된 결과와 함께 인간 iPS 세포의 높은 transfection 효율을 일상적으로 달성할 수 있다는 점입니다. 또한 우리의 프로토콜은 유전자 변형 후 세포 사멸을 최소화합니다. 따라서 우리의 프로토콜을 통해 형질전환 인간 iPS 세포주를 신속하고 대규모로 생성할 수 있습니다. 인간 유도만능줄기세포를 feeder-free 배양에 적응시키기 전에, gelt TRX 코팅 접시를 준비하십시오.

다음으로, 피더 세포에서 배양해 온 인간 IPCs가 담긴 웰당 1 mL의 Accutane을 넣고 37 °C에서 1분 동안, 대부분의 세포가 떨어지기 시작할 때까지 배양합니다. 여기에 유리 비드 10~15개를 추가하고 플레이트를 부드럽게 흔들어 섞어줍니다. 그다음 2 mL의 knockout D-M-E-M-F 12를 첨가하고 부드럽게 파이펫팅합니다. 세포 현탁액을 10 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.

실온에서 800 RPM으로 3분 동안 세포를 원심 분리합니다. 인간 IPSC 펠렛이 손상되지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거합니다. 튜브를 가볍게 쳐서 세포 펠렛을 부드럽게 분산시킵니다.

Reese, 적절한 부피의 STEM pro 배지에 인간 IPSC 펠렛을 현탁하여 gel TRE 코팅 플레이트의 웰에 분주하십시오. 증식 속도에 따라 인간 IPC는 1:2에서 1:6의 분할 비율로 계대 배양할 수 있습니다. 플레이트를 5% carbon dioxide, 37 degrees Celsius 인큐베이터에 조심스럽게 넣고, 플레이트를 가볍게 흔들어 세포가 웰 전체에 고르게 분포되도록 하십시오.

세포에 매일 배지를 공급합니다. 세포의 밀도가 80% confluence에 도달하면 새로운 젤로 다시 계대 배양할 준비가 된 것입니다. 최적의 transfection 효율을 달성하기 위해서는, transfection 당일에 1:2의 분할 비율로 Rex 코팅 웰에 접종한 세포의 밀도가 약 40~50% confluence여야 하며, 작은 콜로니 형태가 젤 코팅 웰 전체에 균일하게 분포되어 있어야 합니다.

이 절차를 시작하려면, 멸균된 1.5 milliliter eend orph 튜브에 100 µL의 knockout medium을 준비합니다. 27 µL의 gene juice transfection reagent를 첨가하고 잘 섞은 후, 실온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 4 µg의 plasmid DNA를 첨가합니다.

최적의 transfection 효율을 위해서는 플라스미드의 선택이 매우 중요합니다. 본 실험에서 사용된 플라스미드는 인간 IPC에서 전사 활성이 강한 promoter인 CAG promoter에 의해 발현되는 enhanced green fluorescent protein을 포함하고 있습니다. 튜브를 상온에서 15분 동안 배양하십시오.

15분 후, gene juice와 DNA 혼합물을 세포에 첨가하고 플레이트를 스웰링(swell)합니다. 트랜스펙션 혼합물과 웰 내의 인간 IPCs 간의 접촉을 높이기 위해 플레이트를 1,200 RPM에서 5분 동안 원심 분리합니다. 다음 날까지 세포를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

형질전환 효율을 모니터링하십시오. 핵 영향 전처리 당일에 인간 IPC를 37 °C에서 최소 1시간 동안 10 µM의 rock inhibitor로 전처리합니다. 인간 IPS CS가 전처리되는 동안, 멸균된 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 82 µL의 인간 줄기세포 핵 효과제 용액을 준비하십시오. 80 µL를 첨가합니다.

보충제를 추가하고 피펫팅하여 잘 섞어줍니다. 용액을 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 미리 준비한 피더 세포 조건 배지와 0.25% trypsin-EDTA를 후드 내에서 37 °C로 예열합니다.

멸균된 15 milliliter 원추형 튜브 하나에 라벨을 미리 붙입니다. 핵 전이(nuclear affected)를 진행할 인간 IPSC 배양액에서 배지를 조심스럽게 제거하고, phosphate buffered saline으로 세포를 부드럽게 세척합니다. PBS를 흡입하여 제거하고 trypsin을 첨가한 후, 37 degrees Celsius에서 3분 동안 세포를 배양합니다.

성공적인 핵 transfection을 위해서는 세포를 단일 세포로 trypsin 처리하지 않는 것이 중요합니다. 대신, 세포를 2~3개의 세포로 구성된 작은 덩어리로 파쇄해야 합니다. P 1000 피펫 팁을 사용하여 세포를 2~3개의 세포로 구성된 작은 덩어리가 되도록 부드럽게 재현탁하십시오.

피펫팅을 반복하여 웰 바닥을 세척함으로써 모든 인간 IPC가 완전히 분리되었는지 확인합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 라벨이 부착된 15 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 다음으로, mouse embryonic fibroblasts 배지 9 milliliters를 추가합니다.

트립신을 불활성화하기 위해 세포를 800 RPM에서 3분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿이 손상되지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거합니다. 세포를 100 µL의 미리 가온된 인간 줄기세포 핵 추출액에 현탁합니다.

1 mL 피펫 팁을 사용하여 세포를 핵 전달 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액에 4 µg의 플라스미드 DNA를 넣고, 가볍게 회전시켜 세포와 DNA를 혼합합니다. 튜브를 후드 표면에 두 번 가볍게 탭합니다.

vete를 핵 효능 장치의 핵 효능 홀더에 삽입하십시오. 버튼 x를 눌러 프로그램 B 0 1 6 핵 효능 세포를 선택하십시오. 핵 효능 과정이 완료되면(보통 1~5초 소요) Okay가 표시됩니다. 핵 효능 키트에 제공된 플라스틱 파스타 피펫을 사용하여 vete에서 핵 효능 세포를 회수하십시오. 멸균된 1.5 milliliter eend orph에 미리 데워둔 CM 및 rock inhibitor를 넣어 세포를 재현탁하여 회수하십시오. 세포를 37 °C에서 10분 동안 배양하십시오.

10분 후, 1mL 피펫 팁을 사용하여 세포를 피더 층(feeder layers) 위에 한 방울씩 떨어뜨려 옮깁니다. 세포를 37°C에서 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날에 transfection 효율을 모니터링합니다.

여기 제시된 사진은 GeneJuice를 사용하여 형질전환한 후 12시간이 지난 EGFP 발현 RIV one 인간 iPSC 세포의 광현미경 사진입니다. 인간 iPSC의 플라스미드 DNA 형질전환. 강한 프로모터와 GeneJuice를 사용하면 일시적 형질전환 분석에서 일반적으로 60% 이상의 EGFP 리포터 발현 세포를 얻을 수 있습니다.

EGFP 발현 세포는 핵 전달을 통해서도 얻을 수 있으며, 이는 B 0 1 6 핵 전달 프로그램 또는 A 0 2 3 핵 전달 프로그램을 사용하여 핵 전달 후 피더 세포 위에 도말하여 형성된 RIV one 인간 IPCs의 이미지에서 확인할 수 있습니다. B 0 1 6 프로그램을 사용한 경우 최대 80%의 EGFP 양성 세포가 나타났으나, A 0 2 3 프로그램에서는 EGFP 양성 세포가 10% 미만으로 나타났습니다. 또한, trends 유전자를 발현하는 형질전환 인간 iPSC의 안정적인 클론을 유도할 수 있습니다.

Gene Juice로부터 유도되어 어디서나 EGFP가 발현되는 안정적인 EGFP 발현 인간 iPSC 콜로니의 예가 여기에 제시되어 있습니다. 이 세포들은 배아체 분화 과정 동안 지속적인 EGFP 발현을 유지합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 인간 iPS 세포를 어떻게 핵 전달 및 형질전환하는지에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

효율적인 유전자 조작은 줄기세포 생물학의 다양한 측면을 연구하는 데 필수적인 도구이며, 재생 의학에서 인간 IPS 세포주의 활용을 가속화할 것입니다.