형광 활성화 세포 분류를 사용한 쥐 망막 신경절 세포 분리

은 세포 스트레이너 위에 쥐 망막을 놓고 원을 그리며 침용하여 망막 세포를 세포외 기질에서 분리합니다.

스트레이너를 수집 튜브로 옮깁니다.

산염 완충액과 혈청 용액을 스트레이너에 첨가하여 세포를 세척하고 수집합니다.

세포를 침전시키기 위해 원심분리기. 상청액을 버리고 세포를 인산염 완충액과 혈청 용액에 재현탁합니다.

세포의 Fc 수용체에 결합하는 차단 항체를 추가하여 표적 항체의 비특이적 결합을 방지합니다.

다음으로, 다양한 세포 유형의 특정 세포 표면 마커에 결합하는 형광 태그 및 태그되지 않은 1차 항체를 추가합니다.

결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척하십시오.

형광 태그가 지정된 2차 항체를 추가하여 태그가 지정되지 않은 1차 항체에 결합합니다.

결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척하십시오.

형광 활성화 세포 분류 또는 FACS를 수행하여 표지된 세포의 고유한 형광 신호를 포착하고 다양한 망막 세포 집단에서 망막 신경절 세포를 분류합니다.

PBS와 FBS로 적신 멸균 70미크론 나일론 스트레이너에 최대 12개의 망막을 놓고 원을 그리며 10밀리리터 주사기 플런저의 뒤쪽 끝으로 망막을 부드럽게 침지시킵니다. 모든 세포가 해리되면 스트레이너를 폴리프로필렌 수집 튜브 위에 놓고 P1000 피펫을 사용하여 스트레이너를 통해 수집 튜브로 세포를 걸러냅니다.

스트레이너를 PBS 및 FBS로 헹구고 세척액을 수집 튜브에 모습니다. 충분한 PBS와 FBS를 추가하여 최종 부피를 망막당 최대 1밀리리터의 용액으로 만들고 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 그런 다음 PBS와 FBS에 펠릿을 망막 농도 5개당 배지 1밀리리터로 재현탁합니다. 다음으로, 실온에서 10분 동안 1 x 10⁶ 세포당 1마이크로리터의 항-마우스 CD16/32 항체로 각 튜브에서 모든 비특이적 FC 수용체 결합을 차단합니다.

차단 배양이 끝나면 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 30분 동안 배양하기 위해 부드러운 피펫팅으로 관심 항체 칵테일을 세포에 첨가합니다. 그런 다음 PBS 및 FBS의 최종 부피 4밀리리터로 세포를 두 번 세척합니다. 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 30분 동안 적절한 2차 항체로 세포를 라벨링한 다음 PBS와 FBS에서 2회 세척한 다음 샘플 튜브를 유세포 분석기에 로드합니다.