세포 네트워크의 창조를위한 플라즈마 리소그래피 표면 Patterning

다음 실험의 전반적인 목표는 마이크로 및 나노 규모에서 발생하는 개별 및 집단 세포 행동과 관련된 생물학적 질문을 연구하기 위해 세포 미세환경을 조성하는 것입니다. 이는 먼저 최종적으로 세포 배치를 유도할 템플릿을 설계함으로써 달성됩니다. 그런 다음, 이러한 설계는 포토리소그래피를 통해 패턴 표면으로 변환되며, 이를 통해 소프트 리소그래피를 이용한 플라스마 차폐 몰드를 제작할 수 있습니다.

마지막으로, 이러한 차폐 몰드를 페트리 접시 내에 삼각대로 배치하여 하단 표면이 플라스마에 선택적으로 노출되도록 하며, 이를 통해 각 몰드 아래 영역에 세포 민감성 화학 패턴이 형성되게 합니다. 이를 통해 세포의 행동이 미세환경 및 인접 세포와의 상호작용에 따라 어떻게 달라지는지 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 세포군 간의 상호작용이 고차원적 현상에 어떠한 영향을 미치는가와 같이, 미세환경이 세포 행동에 미치는 영향에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

그리고 세포 내 나노스케일 단서가 건강한 이동 및 분화와 같은 기능에 어떤 영향을 미칠까요? 먼저, 순간접착제를 사용하여 패턴 슬라이드를 빈 슬라이드 뭉치에 부착합니다. 다음으로, 슬라이드 뭉치보다 약간 더 크고 30 grams의 poly dimethyl suboxane 또는 PDMS를 담을 수 있을 만큼 충분한 크기의 알루미늄 호일 용기를 만듭니다.

슬라이드 적층물을 컨테이너에 넣고, 슬라이드 적층물 위에 PDMS를 부어 초기 몰드를 제작합니다. 그런 다음 컨테이너를 진공 챔버 내부에 넣어 PDMS의 기포를 제거합니다. 흡입 밸브 튜브 위의 손가락을 빠르게 떼었다가 다시 대는 과정을 여러 번 반복하여 챔버 내부로 공기가 잠시 유입되게 함으로써 PDMS에 남아 있는 기포를 터뜨립니다.

밸브를 닫고 5분 동안 중단 없이 탈기를 진행합니다. 그 후, PDMS를 클린 흐름 후드 내의 실온에서 1~2일 동안 경화시킵니다. 경화가 완료되면 PDMS를 마스터 패턴에서 떼어내어 몰드를 형성합니다.

다음으로, 1분 동안 막 혼합한 2액형 에폭시 6g을 마스터 몰드에 얇게 붓습니다. 에폭시가 굳기 전에 여러 번의 기포 제거 사이클을 사용하여 즉시 탈기합니다. 탈기된 에폭시를 한 시간 동안 그대로 두면 부분적으로 경화됩니다.

탈기 과정 없이 몰드에 에폭시를 더 추가하여, 이후 단계에서 다루기 쉽도록 더 두꺼운 구조물을 제작합니다. 그 다음 에폭시를 1~2일 동안 경화시킵니다. 에폭시 몰드가 경화되면 PDMS 마스터 몰드에서 에폭시를 분리한 후, 에폭시 몰드 주변에 테이프를 감아 용기 형태로 만듭니다.

그 다음, 에폭시 몰드 위에 PDMS를 붓고, PDMS의 기포를 제거한 후 새 몰드를 1~2일 동안 경화시켜 작업용 몰드를 제작할 수 있습니다. 작업용 몰드가 경화되면, 에폭시에서 몰드를 떼어내고 청결 상태를 유지하기 위해 유동 후드 내 밀폐 플라스틱 용기에 담긴 페트리 접시 속에 두 몰드를 모두 보관하십시오. 표면 패턴 형성을 위한 몰드를 준비하려면, 면도날로 작업용 몰드를 작은 섹션으로 자른 뒤 해당 섹션들을 페트리 접시에 넣으십시오.

이러한 몰드 섹션들의 위치를 영구 마커를 사용하여 페트리 접시 뒷면에 섹션들이 놓인 곳의 외곽선을 그려 표시합니다. 섹션들로 삼각대를 형성하고, 작업 몰드와 페트리 접시 표면 사이에 정합 접촉이 이루어지도록 삼각대의 무게를 이용하여 고정합니다. 접시 바닥을 살펴 육안이나 소형 확대경으로 확인 가능한 채널의 존재를 통해 배치가 적절히 되었는지 확인합니다. 이 조립체를 플라스마 챔버에 넣습니다.

플라즈마 처리 후 플라즈마 처리를 시작하십시오. 몰드와 무게 배열 장치를 제거하고, 멸균을 위해 페트리 접시를 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내의 UV 램프 아래에 10분 동안 둡니다. 세포를 파종할 때까지 접시를 그곳에 보관하십시오.

선택한 실험 세포를 표준 배양 배지로 희석하여 원하는 합치도(confluence)를 맞춥니다. 패턴 처리된 페트리 접시 표면에 배치할 때, 세포 용액 3 mL를 페트리 접시에 붓습니다. 플라스마 세포에 의해 생성된 패턴 위에 세포가 정렬될 수 있도록, 패턴 처리된 페트리 접시를 37 °C, 5% CO2, 100% 습도 조건에서 수 시간에서 수 일 동안 배양합니다.

위상차 현미경으로 패턴 형성 여부를 확인합니다. 신경모세포종 세포를 배양할 때는 뉴런과 유사한 상태로 세포 분화가 관찰될 때까지 매일 10 µM의 레티노익 산을 첨가하십시오. 표준 세포 배양 배지는 3~4일마다 교체합니다.

플라즈마 리소그래피 기술을 적용한 전형적인 결과는 임의의 구조나 자연적 구조와 유사한 세포 패턴의 형성입니다. 이에 대한 예시로, 레티노산으로 분화시킨 뉴런이 선형 패턴 위에 형성된 모습을 이 그림에서 확인할 수 있습니다. 또한 뉴런의 선 및 네트워크가 생성된 이 그림과 같이, 다음 두 그림에서 볼 수 있듯이 뉴런 이외의 세포 유형도 사용될 수 있습니다. 이 그림은 인간 제대정맥 내피세포를 보여주며, 이 그림은 C2C12 골격근 세포가 격자 구조를 형성하는 모습을 보여줍니다.

폴리리신과 같은 재료를 패턴화하여 특정 세포 유형의 부착을 촉진하거나 다른 용도로 사용할 수도 있습니다. 이 절차 이후에 마이크로플루이딕스, 세포 프로빙 또는 특정 단백질의 유전적 조작과 같은 추가적인 입력을 통합함으로써, 자극의 조합이 고차원적 및 개별 세포 행동에 어떻게 영향을 미치는가와 같은 추가적인 질문에 답할 수 있습니다.