1차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런의 분리 및 배양

마우스 배아의 중뇌 복부 영역에서 분리된 중뇌저 조직을 취합니다.

조직에는 신경 전달 물질인 도파민을 방출하는 도파민 뉴런이 풍부합니다.

효소 용액을 첨가하여 조직 기질을 분해하여 세포를 느슨하게 합니다.

DNase I을 함유한 혈청 용액을 첨가하고 소화된 조직을 기계적으로 해리시켜 세포 현탁액을 생성합니다. 혈청 단백질은 효소를 억제하는 반면, DNase I은 세포 용해 중에 방출되는 세포외 DNA를 분해하여 세포 응집을 방지합니다.

조직 파편이 가라앉도록 하고 부유 세포를 새 튜브로 옮깁니다.

원심분리하여 상청액을 제거한 다음 세포를 도파민 뉴런 배지 또는 DPM에 재현탁합니다.

웰 중앙에 세포 배양 기질로 코팅된 마이크로플레이트를 가져와 마이크로 아일랜드를 만듭니다.

세포를 마이크로 아일랜드의 중앙으로 옮겨 고밀도로 배양합니다.

양하여 세포가 마이크로 아일랜드에 부착되도록 합니다.

웰을 DPM으로 채우고 배양하여 도파민 뉴런의 성장을 촉진합니다.

마우스 배아 13.5일 마우스 배아에서 1차 배아 중뇌 배양을 설정하려면 수확된 모든 중뇌 바닥을 동일한 1.5밀리리터 튜브에 모으고 세척당 500마이크로리터의 칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS로 샘플을 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후 HBSS를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하기 위해 HBSS를 0.5% 트립신으로 교체합니다.

배양이 끝나면 FBS 용액에 새로 준비된 DNase I 500마이크로리터를 부분적으로 소화된 조직에 첨가하고 불로 연마된 팁이 있는 실리콘 유리 피펫을 사용하여 조직을 분쇄합니다. 작고 거의 보이지 않는 입자만 관찰될 수 있는 경우 이러한 조직 조각이 미세 원심분리기 튜브의 바닥에 가라앉도록 하고 상청액을 빈 15밀리리터 원추형 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.

FBS에 DNase I이 들어 있는 튜브에 HBSS 1밀리리터를 넣고 피펫팅으로 여러 번 혼합합니다. 이 용액 1밀리리터를 나머지 조직 입자에 옮기고 샘플을 다시 분쇄합니다. 그런 다음 나머지 조직 조각을 옮기지 않고 소화된 세포 현탁액을 상청액 튜브와 함께 모습니다. HBS의 FBS에 남아 있는 DNase I로 조직 샘플을 한 번 더 분쇄한 후, 수집된 세포를 원심분리에 의해 침전시키고 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡인합니다.

세척당 2밀리리터의 따뜻한 도파민 뉴런 배지로 세포를 2회 세척하고, 미세 원심분리기 튜브에서 신선하고 따뜻한 배지 농도의 6마이크로리터당 3 x 10⁴세포로 세포를 재현탁합니다. 다음으로, 이전에 준비된 각 마이크로 아일랜드에서 배지를 제거하고 10마이크로리터 피펫을 사용하여 각 마이크로 아일랜드에 6마이크로리터의 세포를 추가하기 전에 부드러운 피펫팅으로 세포를 혼합합니다.

모든 세포가 추가되면 플레이트 가장자리의 빈 웰에 150마이크로리터의 물 또는 PBS를 채우고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다. 배양이 끝나면 각 웰에 100마이크로리터의 신선한 도파민 뉴런 배지를 추가하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다.