Name: 마우스 배아 전체 문화 신경 튜브 폐쇄 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 배우세요 마우스 배아 전체 문화 기법을 통해 신경관 폐쇄와 신경축 신장을 연구하는 방법을. 이 기술은 약리학적 조작을 통해 신경 발생의 분자 경로를 탐구하는 데 활용됩니다.

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우리는 해부와 문화 기술과 유용한 조언 A. Hadjantonakis (슬로안 - Kettering 연구소)의 실험실과 L. Niswander (콜로라도 - 덴버 U)의 실험실을 감사드립니다. 이 작품은 L. Niswander와 J. Nadeau (시스템 생물학 연구소)와 공동으로 메르 JDG 및 RO1NS05897에 NRSA NS059562에 의해 지원되었습니다.

1. 문화 미디어의 준비 - 모든 시약은 표 1에 나열되어 <ol><li> 37 해동 남자 쥐 혈청 ° C. </li><li> 55시 30 분에 대한 쥐 혈청을 열 Inactivate ° C </li><li> 상온에서 5 분 10K에 대한 원심의 쥐 혈청 </li><li> 페놀 - 붉은 무료 DMEM w / 높은 혈당과 함께 뜨는와 혼합 50:50를 제거 </li><li> 0.45 음 주사기 필터를 사용하여 미디어를 소독 </li><li> 미디어 / 배아의 최소한 1ml 준비되어야한다 </li></ol> 2. 임신 댐에서 자궁의 분리 <ol><li> 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인 절차를 사용하여 임신 댐 먼저 anesthetized하고 다음 경추 탈구하여 희생 </li><li> 70% EtOH로 복부를 소독 </li><li> 큰 집게로 그냥 유두 선 위에 중간선에 따라 피부의 작은 경로를 꼬집어 대형 가위와 집게 아래 복부를 엽니다. 어떤 내부 구조를 손상하지 않도록주의의 </li><li> 전체 복부가 열려 있도록 마우스의 양쪽 방향으로 초기 오프닝에서 옆으로 절단에 가위를 사용하여 </li><li> 창자와 여분의 지방 패드는 종종 자궁을 가리 수 있으며, 이들은 자궁과 난소의 맨 위에는 양쪽에 관찰 할 수 있도록 별도로 이동합니다 </li><li> 난소 아래 자궁의 상단을 핀치과 다른 난소에 자궁의 한쪽에서 절단, 지방에서 자궁을 분리하여 가위를 사용하여 </li><li> 식염수에 페트리 접시에 포셉, 장소와 자궁을 허용 </li></ol> 3. 자궁에서 태아의 제거 <ol><li> 초과 혈액을 제거하고 외부에서 초과 지방을 장식하기 위해 식염수로 자궁을 씻어 </li><li> 방 온도와 깨끗한 접시에 전송합니다. 시각화을 향상시키기 위해 염분 Tyrodes </li><li> stereomicroscope 사용하여 조심스럽게 떨어져 자궁 껍질에 작은 가위 또는 필요할 경우 벌금 (# 5) 포셉 중 하나를 사용하여 각 배아를 구분합니다. </li> &lt;리&gt;하지 피어스 배아에주의하고, 이번에는 질 벽에과 decidua 사이에는 질 벽에 다시 껍질 공간에 멋진 집게를 넣습니다 </ol> 4. 배아에서 decidua 제거 <ol><li> 동양 decidua 너무 어두운 부분 (태반)은 당신을 멀리 마주보고입니다 </li><li> 너무 깊이 잘라 않도록 조심하고, 밝은 부분에서 decidua의 어두운 부분을 분리 라인 함께 집게와 절개를합니다 </li><li> ectoplacental 원추형 (EPC)를 찢어 않도록 조심하고, 난황 상단에서 태반의 분리를 완료합니다. 이 시점에서 당신은 난황에 Reicherts 막을 시각화 할 수 있어야한다 </li><li> 하지 피어스 난황에주의되는 전체 decidua를 (밝은 부분)를 제거하기 위해 계속 </li><li> 부드럽게 꼬집어 및 EPC에서 물러나고하여 Reicherts를 제거합니다. EPC가 손상 또는 난황에서 분리되면, 태아는 E8.5 - E9.5에서 정상적으로 설정되지 않을 </li><lireicherts somities></lireicherts></ol> 5. 문화 시스템을 설정 <ol><li> 태아가 난황을 손상시키지 않고 pipetted 수 있도록 개방의 직경을 증가 가위로 플라스틱 전송 피펫의 끝을 잘라 </li><li> 배아 당 미디어 1 ML과 깨끗한 롤러 병을 채우십시오. 3-6 배아의 최대 사용하는 롤러 병의 종류에 따라하는 것은 각 병에 로드할 수 있습니다. </li><li> 가능한 작은 Tyrodes 등으로 운반, 미디어 가득한 롤러 병에 커팅 피펫을 사용하여 배아가있는만큼 미디어를 희석하지 송금 </li><li> 유리 롤러 병의 상단에 고무 플러그 (마개)을 첨부 </li><li> 시일이 플러그와 드럼 사이에 형성되도록 롤러 문화 드럼에 롤러 병을 삽입 </li><li> 일단 모든 병이 첨부되어 있고, 드럼에 빈 슬롯이 w를 봉인되었습니다ith 고무 stoppers은 롤러를 활성화 </li><li> CO 2와 O 2 탱크를 열고 콘센트 밸브는 초 당 한 방울을 공개 있도록 약 2 PSI 그들을 조정할 수 있습니다. E8.5 - E10 배아의, 20 % O 2와 5퍼센트 CO 2를 사용해야합니다. </li><li> 인큐베이터가 37로 설정되어 있는지 확인 ° C와 표지 또는 배아가 빛으로부터 격리되도록 배양기를 닫습니다. </li><li> 태아도 somities의 추가, 회전의 진행, 그리고 신경 튜브 폐쇄의 범위에서 자신의 발전을 평가하기 위해 정기적으로 확인하여야한다 </li><li> 문화 2-3시간 후, 약리 억제제 또는 다른 치료가 언론에 추가할 수 있습니다 </li><li> 연구 설계는 자동차 또는 연구 시약의 비활성 analogues 같은 컨트롤을 포함해야합니다. </li></ol> 6. 전체 배아 문화 이후 개발 평가 <ol><li> 가스를 끄고, 롤러를 중지하고, 배양기에서 병을 제거 </li><li> 전송 배아 다시 Tyrode로stereomicroscope에 따라 평가를위한 배양 접시에있는 s 또는 PBS </li><li> 난황은&gt; 120 분 당 비트, 그리고 혈액 순환을 명백히해야한다 심장 박동을 볼 수도과 심장 박동을해야, 풍선처럼 나타납니다 </li><li> 이전에 난황 제거하기 위해 사진의 배아 필요한 경우 </li><li> EPC 근처에 구멍을 절단하고 배아의 머리와 엉덩이에 걸쳐 난황과 양막을 틀지하여 배아의 난황을 제거합니다. </li><li> 탯줄은 태아의 난황을 분리자를 수 있으며, 난황이 필요한 경우 배아를 genotyping 사용할 수 있습니다. </li><li> 이러한 오픈 두개골 주름, 얼굴 및 / 또는 오픈 꼬리 neuropore의 불완전한 폐쇄로 체절 번호와 신경 튜브 결함에 대한 배아를 검사합니다. 배아는 여러 morphogenetic 변경 Theiler 분류 (에 따라 공연 수 있습니다 <a href="http://genex.hgu.mrc.ac.uk/Databases/Anatomy/MAstaging.html">emap / home.html을 http://www.emouseatlas.org/</a> 다시)의 사진 기록배아 개발에 유용합니다. </li></ol> 7. 노트 <ol><li> 어떤 별명이나 난황에 눈물이 성공적으로 선회를 방지하고 정상적인 발달을 억제하기 때문에 고품질의 절개가 필수적입니다. EPC는 또한 Reichert의 멤브레인 (RM)의 제거 중에 손상될 수 있으며 EPC가도 부분적으로 난황에서 분리된 경우 배아가 정상적으로 발전하지 않습니다. 그러나, RM의 불완전한 제거는 배아가 또는 RM 세포 문화에 자라다와 정상적인 발전을 방지 둘 다있는 난황 확장, 혈관 수 있습니다 뭉쳐 및 /가 발생할 수 있습니다. </li><li> 썩은 또는 구부러진 집게는 프로 시저가 훨씬 더 어려워하기 때문에 깨끗하고 날카로운 집게가 좋은 절개를 받고하는 비밀입니다. 악기에 단백질 예금은 조직 손상으로 이어질 것입니다. </li><li> 깨끗하고 무균 유리​​병 또한 측면 벽에 고집하고 손상되는 배아를 방지하기 위해 필수적입니다. 전에 실험을 시작하기 위해, 병 SCR해야, 비누와 물로 ubbed DH 2 O에 씻어서, 그리고 물 종기까지 각 병에 물을 작은 양의 microwaved. 병 그 다음 70% EtOH로 씻어서 건조 공기 사용할 수 있습니다. </li><li> 빨리 배아 문화 미디어로 전송 수 있으며 ° C 더 나은 생존을 37로 다시 따뜻하게하기 때문에, 가능한 빨리 작동합니다. </li><li> 각각의 배아가 배아의 성장에 차이를 만드는 피하기 위해 시간의 동일한 금액에 실온에서되도록 롤러 병 어떤 배아를 전송하기 전에 전체 쓰레기를 해부 완료 </li><li> 문화의 세균 오염을 방지하기 위해 멸균 환경을 유지합니다. 우리 문화 실험은 항생제없이 수행하지만, 많은 실험실은 박테리아의 성장을 방지하기 위해 미디어에 항생 추가되었습니다. 이 실험의 시작 부분에 있었어요으로 매체 실험의 끝에처럼 맑은 나타납니다. 미디어 흐린되었다 또는 가시 침전물이있다면 절약 가능성이 높습있다당신의 문화를 감염 tamination. </li><li> 비효과 가스 교환도 배아 개발 지연 때문에 지속적인 전달을 보장하는 안정적인 조절을 확인하실 수 있습니다. </li><li> 배아는 전직 생체내 문화에 약 50 % 느린 개발, 그러므로 당신이 실험의 완료 개발의 적절한 단계에 도달했는지 확인하기 위해 somites를 계산하는 것이 필수적입니다. </li></ol> 8. 대표 결과 : 배아의 모양 사전 및 사후 롤러 문화 그림 1에서 보여주고있다. 해부 당시 태아는 꼬리가 머리 폴드 뒤에 선반 가공을하지 않은 구성 (그림 1A, D)에 있어야합니다. 문화의 36 시간 후, 배아들은 꼬리가 머리 (그림의 1B, C, E, F)의 앞에있는 C - 곡선, 태아형 자세에서되도록 전환 완료해야합니다. RhoA 키나제 저해제 (Y - 27632), 동안 집중 확장 알려진 억제제 약리 조작neurulation (Ybot - 곤잘레스, 2007), 그들의 주동이의 - 꼬리 축 (그림 1E, F)을 따라 배아 및 두개골 신경 배 폐쇄를 억제의 단축을 초래합니다. 우리의 데이터는 Y - 27632의 양이 점차 증가 두개골 배 폐쇄 impairs (그림 2A) 및 다운 스트림 RhoA는 두개골 neurulation과 집중 확장 신호의 역할과 일치 바디 축 (그림 2B)를 단축 것을 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig1.jpg"> 그림 1. 약리 억제제 Y - 27632와 함께 문화 배아 및 조작의 외관. 이전에 전체 배아 문화 E8.5에서 (A, D)를 해부 배아 (B, E) 난황 롤러 문화의 36hrs에, 아직도 건재 이후로 E10에 태아. (C, F) 난황은 성공적인 전환과 신경 튜브 폐쇄를 설명하기 삭제되었습니다. Rho 키나제 억제제 Y - 27632 (E, F)로 처리되었습니다 배아는 제대로 수렴 확장자를 받아야하고 설명하는 데 실패짧은 바디 축. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig2.jpg"> 그림 2. 두개골 신경 튜브 폐쇄 및 축 신장에서 RhoA의 키나제 억제제의 효과. (A) (% NTC = 비율 신경 튜브 폐쇄)은 두개골 주름을 성공적으로 닫을 수 있었다 배아의 비율은 Y - 27632의 복용량 비교 문화 미디어에 추가됩니다. (B) 귀의 소포와 forelimb 사이의 거리는 상당히 Y - 27632의 증가 복용 (P는 &lt;0.05)에서 감소했다.

<ol><li>Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCockroft%2C+DL+%22Mammalian+Postimplantation+Embryos+A+Practical+Approach%22">Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach</a>. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. (1990).</li>
<li>Gray, J. D., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+folate+supplementation+from+Crooked+tail+and+other+NTD-prone+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+A.+Clin.+Mol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).</li>
<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+Atlas+of+Mouse+Development%22">The Atlas of Mouse Development</a>. , Academic Press Limited. San Diego. (1992).</li>
<li>Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+extension%2C+planar-cell-polarity+signalling+and+initiation+of+mouse+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure.</a> Development. 134, 789-799 (2007).</li>
<li>Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-environment+interactions%2C+folate+metabolism+and+the+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Syst+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

개발하는 동안 배아에 내장하는 사람에서 산모, 자궁 내 요인을 구분하는 능력은 embryogenesis의 모든 단계를 공부를위한 중요한 도구입니다. 여기함으로써 약물의 산모 대사의 변수를 제거 두개골 neurulation의 전 제품 utero에서 RhoA의 키나제의 작은 분자 억제제의 효과를 분석했습니다. 이 약리 조작 두개골 neurulation과 집중 확장에 지대한 영향을했습니다. 이 화합물에 감도는 서로 다른 유전자 돌연변이 마우스 가운데 비교할 수 있습니다. 여기서 제시하는 방법은 시약의 다양한 사용하여 배아에서 세포 기능의 직접 조작하므로 개발에있는 다른 분자 경로의 연구에도 적용될 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 해부에 대한 Stereomicroscope </td><td> Leica </td><td> M165 </td><td></td></tr><tr><td> 정밀 보육 </td><td> BTC 공학 (영국) </td><td> BTC 001 </td><td></td></tr><tr><td> 회전 병 문화 단위 </td><td> BTC </td><td> BTC 003 </td><td></td></tr><tr><td> 단위 회전을위한 유리병 </td><td> BTC </td><td> BTC 005 </td><td></td></tr><tr><td> 실리콘 고무 마개 </td><td> BTC </td><td> BTC 007 </td><td></td></tr><tr><td> 실리콘 고무 코르크 </td><td> BTC </td><td> BTC 008 </td><td></td></tr><tr><td> 가스 버블러 인렛 </td><td> BTC </td><td> BTC 012 </td><td></td></tr><tr><td> 가스 버블러 유입 함정 </td><td> BTC </td><td> BTC 013 </td><td></td></tr><tr><td> 가스 버블러 아울렛 </td><td> BTC </td><td> BTC 014 </td><td></td></tr><tr><td> 봄베 </td><td> TechAir </td><td></td><td> 20% O 2, CO 2 5퍼센트 </td></tr><tr><td> 가스 조정기 </td><td> TechAir </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 남성 쥐 세럼 </td><td> 할란 실험실 </td><td> 4520 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM W / O 페놀 레드 </td><td> Invitrogen </td><td> 31,053 </td><td></td></tr><tr><td> 10 ML 주사기 </td><td> BD </td><td> 309,604 </td><td></td></tr><tr><td> 주사기 필터 </td><td> Nalgene </td><td> 190-2545 </td><td></td></tr><tr><td> 대형 분석 해 봅시다 가위 (둔기 팁) </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td><td></td></tr><tr><td> 엑스트라 파인 본에서 가위 </td><td> 좋은 과학 도구 (FST) </td><td> 14084-08 </td><td></td></tr><tr><tD&gt; Dumot # 5 포셉 </td><td> FST </td><td> 11252-50 </td><td></td></tr><tr><td> Tyrode의 염분 </td><td></td><td></td><td> 마찬가지로 1990 년 Cockroft 설명 </td></tr><tr><td> 10cm 일회용 페트리 접시 </td><td> BD </td><td> 351,029 </td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 배아 전체 문화 신경 튜브 폐쇄

Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

유전자 마우스 모델은 포유류의 신경 튜브 폐쇄의 연구에 중요한 도구입니다 (회색 &amp; Ross에서 2009 년, 로스, 2010). 그러나, utero에서 마우스 배아의 연구는 직접 pharmacologically 관심 시약에 산모 대사의 영향으로부터 격리 배아를 조작하기 위해 무능력에 의해 제한됩니다. 다이어트를 통해 또는 사출에 의해 작은 분자, 재조합 단백질, 또는 siRNA, 어머니 이러한 물질의 전달을 사용하든하면 그들은 배아에 도달하지 못하도록 할 수 신체적 방어의 다양한 이러한 불안 정한 화합물을 적용합니다. 전체 배아의 문화의 조사는 개발에 본질적인 영향 태아에서 산모 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 절개 후 정상적인 신경 튜브 폐쇄 (크로켓, 1990)을 허용 롤러 인큐베이터 기기에서 높은 농축 미디어를 사용 culturing 마우스 배아에 대한 방법을 제시한다. 일단 문화, 배아 수배아는 utero 아직이라면 그렇지 않으면 불가능했을 체외 기법에서 기존 사용하고 조작합니다. 배아 형제 자매는 (두개골 접어 꼬리 neuropore의 결론에 E9.5 - 10 E7 - 7.5에서 발생 neurulation의 다양한 측면을, (neurulation의 개시에 직전 신경 판 형성) 연구에 여러 시간 지점에서 수령 가능 클로저, 카우프만은, 1992). 이 프로토콜에서는, 우리는 두개골 neurulation의 학습을위한 최적의 아르 timepoints에서 배아를 해부위한 방법을 보여줍니다. 배아는 신경 튜브 폐쇄의 개시 이후지만, 이전에 배아 돌려 두개골 신경 접어 클로저로, E8.5 (약 10-12 somities)에서 해부하고, E10 (26-28 somities)까지 문화에 유지됩니다 때 두개골 neurulation가 완료되어야합니다.

산모 신진 대사를 무시 neurulation 동안 마우스 배아의 직접적인 약리 조작에 대한 허용하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 시점과 약리 에이전트를 변화하여 neurulation의 다양한 측면을 연구하기 위해 적용할 수 있습니다.

유전적 마우스 모델은 포유류의 신경관 폐쇄 연구에서 중요한 도구입니다 (Gray & Ross, 2009; Ross, 2010). 하지만 마우스의 연구는...

이 절차의 전반적인 목표는 조건을 정의할 수 있는 자궁 외 환경에서 생쥐 배아의 신경축 신장 및 신경관 폐쇄 과정을 모니터링하는 것입니다. 이를 위해 먼저 임신 8.5일(gestational or embryonic day 8.5)의 마취된 임신 생쥐로부터 자궁각을 제거합니다. 그 다음, 개별 생쥐 배아를 난황낭과 탈락막의 상당 부분이 온전하게 유지된 상태로 자궁에서 분리합니다.그 다음, 외배아 탈락막 조직을 잘라내어 외태반 원추(ecto placental cone)가 온전하게 남도록 합니다. 이 절차의 마지막 단계는 난황낭에 싸인 배아를 약물 처리 여부에 따라 적절한 배지가 담긴 롤러 병(roller bottle)으로 옮기고, 가스가 지속적으로 공급되는 배양기에서 18 내지 24시간 동안 배양하는 것입니다. 최종적으로 체절의 점진적인 추가, 신경절의 접합, 그리고 배아가 태아 자세의 전형적인 C자형 곡선으로 굽어지며 폐쇄되는 결과를 얻을 수 있습니다.이 방법은 정상적인 신경관 폐쇄에 어떤 분자 경로가 관여하는지와 같이 해당 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 특히 신경관 결손(NTDs)을 유발하는 유전적 변이를 가진 배아에서 정상적인 신경관 형성을 촉진하는 데 도움이 되는 약제나 보충제는 무엇인지 확인할 수 있습니다. 박리 과정의 단계들이 매우 까다로울 수 있으므로, 이 기술에 대한 시각적 시연은 매우 중요합니다.배아는 크기가 작아 쉽게 손상될 수 있으며, 난황낭의 손상은 순환계의 발달을 저해하고 회전 및 추가적인 성장을 방해하여 성공적인 결과를 얻지 못하게 할 수 있습니다. 우선, 수컷 쥐 혈청을 37°C에서 해동하여 배양액을 준비합니다. 그다음, 쥐 혈청을 55°C에서 30분 동안 비활성화합니다.그 후 10,000 RPM에서 5분 동안 원심 분리합니다. 상온에서 상층액을 제거하고, 이를 고농도 포도당이 함유된 phenol red free DMEM과 1:1 비율로 혼합합니다. 0.45 micron 시린지 필터를 사용하여 배지를 멸균합니다.자궁을 분리하여 배아를 제거하기 위해 식염수가 담긴 페트리 접시에 넣습니다. 먼저 자궁을 식염수로 헹구어 과잉 혈액을 제거하고 외부의 불필요한 지방 조직을 잘라냅니다. 스테레오 현미경 하에서 시각화를 개선하기 위해, 스테이지 위에 손을 고정시킨 상태에서 자궁을 실온의 tyro saline이 담긴 깨끗한 접시로 옮깁니다.작은 가위나 미세 핀셋을 사용하여 자궁을 벗겨내어 각 배아를 분리합니다. 자궁벽과 탈락막 사이의 공간에 미세 핀셋을 삽입하고, 난황낭이 파열되지 않도록 최소한의 장력을 가해 자궁벽을 벗겨냅니다. 그다음, 태반이 본인 반대 방향을 향하도록 탈락막의 방향을 맞춥니다.그런 다음 포셉을 사용하여 해당 선을 따라 절개하여, 탈락막의 어두운 부분과 밝은 부분을 분리합니다. 이때 너무 깊게 절개하지 않도록 주의하십시오. 태아낭 상단에서 태반의 분리를 완료합니다.외태반 원추(ecto placental cone 또는 EPC)가 찢어지지 않도록 주의하십시오. 이 시점에서 난황낭의 리커 막(riker membrane)이 보여야 합니다. 난황낭에서 리커 막을 제거하는 과정은 이 절차에서 가장 어려운 부분이며, 인내심과 정교한 손길이 필요합니다.난황낭에 손상을 주지 않고 리커(riker)를 정교하게 제거하기 위해, 탈락막 전체를 계속해서 제거합니다. 난황낭을 찌르지 않도록 주의하면서, 리커 막을 EPC에서 벗겨내어 조심스럽게 집어 제거합니다. 만약 EPC가 손상되거나 난황낭에서 분리되면, 배아는 E 8.5에서 E 9.5 사이에 정상적으로 회전하지 못하게 됩니다.리커 막(riker's membrane)을 제거하면 배아가 난황낭을 통해 쉽게 보일 것입니다. 이삭(otic vesicle) 아래부터 시작하여 꼬리 끝까지 한쪽 측면을 따라 체절(somites)의 수를 세어 배아의 단계를 결정하십시오. 플라스틱 전이 피펫의 끝을 잘라 난황낭을 손상시키지 않고 배아를 다룰 수 있도록 준비하십시오.깨끗한 롤러 병에 배아당 1 mL의 배지를 채웁니다. 사용하는 롤러 병의 종류에 따라 병당 최대 3~6개의 배아를 넣을 수 있습니다. 절단된 피펫을 사용하여 배아를 배지가 채워진 롤러 병으로 옮기되, 배지가 희석되지 않도록 tyros는 가능한 한 적게 옮깁니다.유리 롤러 병 상단에 고무 마개를 부착합니다. 마개와 드럼 사이에 밀착된 씰이 형성되도록 롤러 병을 롤러 배양 드럼에 삽입합니다. 모든 병을 부착한 후, 드럼의 빈 슬롯은 고무 스토퍼로 밀봉합니다.그런 다음 롤러를 작동시킵니다. 이어서, CO2 O2 프리믹스 탱크를 열고 출구 밸브에서 초당 하나의 기포가 배출되도록 약 2 PSI로 조정합니다. E 8.5, E 10 배아의 경우, 20%O2와 5%CO2를 사용해야 합니다.인큐베이터가 37°C로 설정되어 있는지 확인하고, 배아가 빛에 노출되지 않도록 인큐베이터를 덮거나 닫습니다. 배아의 발달 상태를 평가하기 위해, 배양 2~3시간 후 체절의 형성, 회전의 진행 정도 및 신경관 폐쇄 범위를 주기적으로 확인합니다. 필요한 경우, 약리학적 억제제나 기타 처리를 추가합니다. 배양이 완료되면 가스를 끄고 롤러를 정지시킨 후 인큐베이터에서 병을 꺼냅니다.배아를 페트리 접시의 tyros 또는 PBS로 다시 옮깁니다. 실체 현미경 하에서 난황낭이 풍선처럼 보여야 하며, 심장 박동이 관찰되고 혈액 순환이 분명하게 나타나야 합니다. EPC 근처에 구멍을 내어 난황낭을 자르고, 난황낭과 양막을 배아의 머리와 엉덩이 쪽으로 뒤집어 배아로부터 난황낭을 제거합니다. 탯줄을 잘라 난황낭을 배아로부터 분리합니다.마지막으로, 배아의 수와 더불어 개방된 두개 접힘, 안면의 불완전한 폐쇄 또는 개방된 후신경공과 같은 신경관 결손 여부를 검사합니다. 배아는 여러 형태 발생적 변화를 기반으로 한 Tyler 분류법에 따라 단계를 설정할 수 있습니다. 롤러 배양 전후 배아의 모습이 여기 해부 시점에 예시되어 있습니다. 배아는 꼬리가 머리 접힘 뒤에 위치하는 뒤집히지 않은 상태여야 합니다.배양 후 24시간이 지나면, 배아는 회전을 완료하여 꼬리가 머리 앞에 위치하는 C자형 태아 자세를 갖추어야 합니다. 이 이미지의 윗줄은 억제제를 첨가하지 않은 배아의 발달 과정을 보여줍니다. 아랫줄은 알레이션(alation) 과정 중 수렴 신장(convergent extension)의 알려진 억제제인 row A kinase 억제제 Y 2 76 32를 이용한 약리학적 조작의 효과를 보여줍니다.이 억제제는 미측 축을 따라 배아의 길이를 단축시키며 두개 신경절 접힘의 폐쇄를 억제합니다. 당사의 데이터에 따르면 Y 2 7 6 3 2의 농도를 높일수록 두개 신경절 접힘 폐쇄가 점진적으로 손상되고 체축이 단축되며, 이는 두개 신경절 및 수렴 신장(convergent extension)에서의 downstream row A 신호 전달의 역할과 일치합니다. 숙련된 경우, 6~12마리의 배아 한 배집단에 대한 해부 기법은 60~90분 내에 완료될 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면, 시스템 수준에서 발생 기전을 연구하기 위해 임신 8.5일에서 10일 차의 마우스 배아를 배양하는 데 필요한 단계들을 충분히 이해하게 될 것입니다.

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신경과학

전체 배아 문화 기술 문화 마우스 및 쥐 배아 우리에게...

회전 형 바틀 문화 시스템을 사용 로던트 전체 엠브료 문화의 방법

이 비디오 프로토콜은 배아 일 14 마우스 뇌의 ganglionic eminences에서 신경 줄기 세포의 분리 및 확장에 대한 neurosphere 분석의 응용 프로그램을 보여줍니다.

Neurosphere 분석을 사용하여 마우스 배아 신경 줄기 세포 문화 구축

신경 튜브의 배아 신경 능선의 분리가의 사용을...

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

두개골 mesenchyme 가능성이 신경 주름 상승을위한 원동력을 제공 극적인 morphogenic의 움직임을...

두개골 Mesenchyme의 셀룰러 행동을 평가하기위한 Explant 분석

여기에서 우리는 필요한 도구를...

생체 마우스 Neuroepithelium에서 단일 세포 분열의 라이브 영상

배아 배양에 활용 혈청 특히 신호의 상호 작용을 포함하는 연구 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 알 수없는 구성 요소가 포함되어 있습니다. 여기서 우리는 혈청 산소 배양 시스템을 활용하고 16-40 시간 동안 배양 한 중간 회임 마우스 배아가 자궁에서 개발 태아에 비해 형태 개발을 전시 것을 보여줍니다.

무 혈청 전체 배아 배양 시스템에서 마우스 배아 개발

포유류 전체 배아 배양 (WEC)은 기형학 및 발달 생물학에서 널리 사용됩니다. 즉시 원심분리된 랫드 혈청은 일반적으로 마우스 및 랫드 WEC 모두를 위한 배지로 제공됩니다. 이 비디오에서는 포유류 WEC에 적합한 고품질 쥐 혈청을 준비하기 위한 표준 프로토콜을 보여줍니다.

포유류의 전체 배아 문화에 적합 쥐 혈청의 제조

여기, 전자13 마우스 배아 절 예 하에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 새로운 microsurgical 기술을 소개합니다.

절연 및 마우스 배아 신경 줄기 세포의 문화

이 프로토콜은 주로 세포 이동 연구를 위해 마우스 모델에서 두개골 신경 문장 세포의 해부 및 배양을 설명합니다. 우리는 사용된 살아있는 화상 진찰 기술 및 속도 및 세포 모양 변경의 분석을 기술합니다.

신경 문장 세포 박리 및 이동의 연구를 위한 마우스에서 1 차적인 두개골 신경 문장 세포의 해부, 문화 및 분석

이 프로토콜은 병아리 배아 신경 형성 중 신경판 조직의 기계적 특성을 종단적으로 모니터링하기 위해 개발되었습니다. Brillouin 현미경과 무대 배양 시스템의 통합을 기반으로 하며, 배 양된 병아리 배아에서 신경판 조직의 실시간 기계적 이미징을 가능하게 합니다.

병아리 배아의 신경관 폐쇄 중 조직의 기계적 진화 모니터링

배우세요 마우스 배아 전체 문화 기법을 통해 신경관 폐쇄와 신경축 신장을 연구하는 방법을. 이 기술은 약리학적 조작을 통해 신경 발생의 분자 경로를 탐구하는 데 활용됩니다.

마우스 배아 전체 문화 신경 튜브 폐쇄

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