단일 셀 RT - PCR 기법을 사용 Nigral 뉴런의 전압 - 문이 칼륨 채널 mRNA의 표현을 프로파일

이 절차의 전반적인 목표는 개별 뉴런에서 전령 RNA를 검출하는 것입니다. 이는 개별 뉴런을 패치로 고정하고 기록한 다음 Mr.mRNA와 세포질에서 기록된 각 뉴런의 세포질을 완전히 흡인함으로써 수행됩니다. CD NA는 PCR에 의해 만들어지고 증폭됩니다.

궁극적으로, 수용체, 이온 채널 및 효소에 대한 특정 mRNA는 기존의 겔 이미징 시스템을 통해 검출할 수 있습니다. 제 이름은 테네시 대학교 보건 과학 센터에서 일하고 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 단일 신경에서 MRI의 양이 매우 적고 쉽게 잃어버리기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

바이브레이터를 사용하여 실질적 흑질의 중간 주부 부분을 포함하는 300마이크로미터 두께의 관상 뇌 절편을 절단하여 이 프로토콜을 시작합니다. 뇌는 15일에서 40일 된 spra dolly 쥐에서 분리할 수 있습니다. 슬라이스 절단 절차는 95 % 산소와 5 % 이산화탄소로 산소화 된 고 자당 절단 용액에서 얼음처럼 차갑게 수행되며 pH 7.4에서 인공 대뇌 척수액에 슬라이스를 배양하고 5 % 이산화탄소, 95 % 산소 가스로 거품을 일게합니다.

온도를 섭씨 34도로 유지하고 슬라이스를 45분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 녹음할 때까지 뇌 절편을 실온에서 유지합니다. 먼저 뇌 절편 하나를 패치 클램프 기록 챔버로 옮깁니다.

섭씨 32도에서 산소가 공급된 인공 뇌척수액을 지속적으로 관류합니다. DNA와 RNA가 없는 물로 준비된 오토클레이브 세포 내 용액으로 패치 피펫을 채웁니다. 적재된 피펫을 수조에 내립니다.

저항이 2에서 3메가옴 사이인지 확인하십시오. 먼저, 뚜렷하고 해부학적인 위치로 실질적 흑질을 찾습니다. 그런 다음 namar 광학 장치와 60 x 대물렌즈를 사용하여 SNC 및 SNR에서 대형 셀을 선택하여 기록합니다.

이들은 주저 없이 가능한 도파민 또는 GABAergic 뉴런입니다. 기존의 giga tight seal 전체 셀 구성을 사용하여 전류 클램프 및 전압 클램프를 만듭니다. 이러한 기록은 일반적으로 mRNA 분해를 최소화하기 위해 5분 이내에 수행되어야 합니다.

약 1분 안에 관심 뉴런의 막과 스파이크 특성만 기록하여 관심 뉴런에 대한 전기생리학적 지문을 제공할 수 있습니다. 관심 있는 뉴런에서 데이터를 얻은 후 부드러운 구강 흡입을 사용하여 세포질을 흡인합니다. 그렇지 않은 경우와 같이 단단한 밀봉이 파손되어서는 안 됩니다.

mRNA를 포함한 세포 외 파편이 패치 피펫으로 빨려 들어가 세포 내용물을 오염시킬 수 있습니다. 피펫 팁을 부수고 가벼운 양압을 가하여 세포 내용물을 0.2ml PCR 튜브로 배출합니다. 완료되면 즉시 튜브를 음극 20 냉동고에 넣어 mRNA를 포함할 수 있는 세포 외 파편의 오염을 배제합니다.

흡인을 사용하지 않고 조직 안으로 내려간 패치 피펫의 내용물을 수집하여 음성 대조군을 만듭니다. 10개에서 20개 사이의 세포 내용물을 수집한 후 뉴런은 즉시 역전사 반응을 시작합니다. mRNA의 분해를 최소화하려면 먼저 오염된 게놈 DNA를 섭씨 25도의 DNA로 5분 동안 소화합니다.

이 단계는 잠재적인 가양성을 줄이는 데 중요하며 우회해서는 안 됩니다. 그런 다음 1.2마이크로리터의 25밀리몰 EDTA가 있는 DNA를 비활성화하고 섭씨 70도에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 이제 시판되는 키트를 사용하여 CD NA를 합성하여 게놈 DNA가 완전히 제거되었는지 확인합니다.

역전사효소 없이 각 샘플의 대조 반응을 실행합니다. 다른 모든 반응 성분은 동일하게 유지됩니다. PCR 설계에 필요할 때까지 제품을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.

Gen bank의 염기서열에 따른 프라이머는 가능할 때마다 게놈 DNA 오염을 검출하는 데 도움이 되는 프라임 복구를 포함하는 T 인트로를 만듭니다. 프라이머 쌍의 효과를 확인하려면 첫 번째 단계에서 전뇌 CD NA에서 테스트하십시오. PCR은 표준 열 순환 프로토콜을 사용하여 35 사이클 동안 30 마이크로 리터 CDNA의 5 마이크로 리터를 증폭합니다.

두 번째 단계의 경우, PCR은 동일한 프라임 복구로 1 마이크로 리터의 첫 번째 단계 PCR 제품을 증폭하고 약간 수정 된 사이클링 프로파일을 사용합니다. 이제 2.5%AGROS 젤에서 제품을 분리하고 AUM 브로마이드 또는 젤 그린을 사용하여 시각화합니다. 자외선 아래에서 positive DNA band를 절제하고 시판되는 키트를 사용하여 DNA를 수집하여 염기서열을 분석합니다.

실질적 nigra, pars, compacta 및 pars reticulata에 있는 뉴런의 전기생리학적 특성을 비교했습니다. SNR GABAergic 뉴런은 약 10헤르츠에서 더 높은 주파수, 자발적인 스파이크를 나타냈습니다. 스파이크는 과분극 전류 주입 시 약 1밀리초의 기본 지속 시간을 가졌습니다.

SNR GABAergic 뉴런은 매주 활성화된 전류를 나타내는 미묘한 SAG 반응을 보였습니다. 대조적으로, 니그로 도파민 뉴런은 약 3밀리초의 기본 지속 시간을 가진 저주파 자발적 스파이크를 나타냈습니다. 도파민 뉴런은 또한 과분극에 대한 반응으로 뚜렷한 SAG를 보였는데, 이는 SNR GABAergic 뉴런에서 IH 전류의 강한 발현을 나타내지만 도파민 뉴런에서는 그렇지 않습니다.

단세포 R-T-P-C-R은 GABA 합성의 핵심 효소인 글루탐산 탈카르복실라제 1에 대한 mRNA를 검출했습니다. 대조적으로, SNC 및 SNR 도파민 뉴런은 확인되었지만 GABAergic 뉴런에서는 확인되지 않았습니다. 단세포 R-T-P-C-R은 도파민 합성의 핵심 효소인 티로신 하이드록실라제에 대한 mRNA를 검출했습니다.

다음으로 단일 셀 R-T-P-C-R을 사용하여 전압 활성화 KV 3 채널 서브 유닛의 발현을 프로파일 링하는 데 사용되었으며, 이는 전압 게이트 칼륨 채널의 특성을 변화시킵니다. 예시 SNR gaba에서, KV 3.1, 3.2, 3.3 및 3.4에 대한 뉴런 mRNA는 예시 S-N-R-D-A 뉴런에서만 검출되었습니다. KV 3.2, 3.3 및 3.4는 풀링된 데이터에서 감지되었습니다.

KV 3.1은 니그로 도파민 뉴런보다 SNR GABAergic 뉴런에서 더 자주 검출되었으며, 이는 빠른 Viking SNR GABA 뉴런에서 KV 3.1의 발현 수준이 더 높았음을 나타냅니다. 이 절차를 시도하는 동안 장갑을 착용하고 개발 후 도구를 과학적으로 자유롭게 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 신경 과학 분야의 연구자들이 신경계의 수용체 및 이온 채널의 발현과 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.