신경교세포의 단세포 이미징을 위한 초파리 뇌의 면역형광 염색

세포 특이적 재조합효소 시스템을 포함하는 다양한 신경교세포 유형을 포함하는 형질전환 초파리 파리의 뇌부터 시작합니다.

이는 동일한 유형의 세포에서 서로 다른 항원 에피토프에 융합된 세포 표면 단백질의 발현을 유도합니다.

을 고정제로 처리하여 단백질을 가교하고 조직 구조를 보존합니다.

과도한 고정액을 제거하기 위해 씻으십시오.

백그라운드 염색을 줄이기 위해 비특이적 결합 부위를 마스킹하기 위해 차단 단백질을 추가합니다.

신경교세포에서 발현되는 다양한 에피토프에 결합하는 1차 항체 칵테일과 함께 조직을 배양합니다.

결합되지 않은 1차 항체를 제거하기 위해 세척합니다.

1차 항체에 결합하는 형광단 접합 2차 항체와 함께 배양합니다.

결합되지 않은 2차 항체를 제거하기 위해 세척합니다.

이미징 스페이서 안에 뇌를 장착하고 커버슬립을 놓습니다. 스페이서는 조직을 위한 챔버를 생성하여 3차원 구조를 보존합니다.

서로 다른 형광단 접합 항체로 표지된 동일한 신경교 유형의 서로 다른 세포를 통해 세포-세포 상호 작용을 이해할 수 있습니다.

P10 피펫 팁을 사용하여 분리된 뇌를 고정 용액이 있는 200마이크로리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 집게를 사용하여 뇌를 다루지 마십시오. 빛으로부터 보호된 조직을 배양합니다. 용액 전달 중에 뇌를 흡인하지 마십시오.

고정액을 제거하려면 세척액과 함께 15분 동안 세 번 이상 세척하십시오. 그런 다음 차단 용액으로 조직을 30분 이상 차단합니다. 다음으로, 차단 용액을 세척액에 희석한 1차 항체로 교체하고 뇌를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

1차 항체를 제거하려면 세척액에서 1시간 동안 세 번 세척합니다. 다음으로, 세척액에 2차 형광단 접합 항체를 첨가하고 뇌를 섭씨 4도에서 밤새 또는 실온에서 4시간 동안 배양합니다. 결합되지 않은 항체를 완전히 씻어내려면 세척액에서 1시간 동안 세 번 세척한 다음 PBS로 더 오래 세척합니다.

그런 다음 두뇌를 장착하십시오. 이미징 스페이서가 있는 두 개의 커버슬립을 준비합니다. 스페이서와 여분의 커버슬립에 퇴색 방지제와 함께 10마이크로리터의 마운팅 매체를 도포합니다. 다음으로, P10 피펫을 사용하여 뇌를 커버슬립으로 옮기고 일부 PBS와 함께 배지 옆에 증착합니다. 티슈가 마르지 않도록 하십시오.

이제 피펫을 사용하여 뇌를 장착 매체로 조심스럽게 이동합니다. 마지막으로 스페이서의 매체로 옮기고 집게로 배열합니다. 그런 다음 스페이서의 접착 라이너를 제거하고 커버슬립을 부착합니다. 집게를 사용하여 약간의 압력으로 커버슬립을 고정하고 즉시 이미징을 진행합니다.