Name: 어쿠스틱 Microstreaming를 사용하여 표준 실험실 역방향 Transcriptase 반응에서 mRNA의 단일 세포로부터 cDNA 수량 산출 증가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: 학습하세요 어쿠스틱 마이크로스트리밍을 활용한 마이크로믹서를 사용하여 단일 세포 mRNA로부터 cDNA 수율을 증가시키는 방법을. 이 기술은 표준 역전사 반응에서 유전자 발현 분석의 정확도를 향상시킵니다.

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이 연구는 국민 건강과 호주의 의료 연구위원회 (프로젝트 부여 안돼. 6,288,480)와 스코비와 클레어 맥키논 트러스트에 의해 지원되었다.

1. RT 반응을 Micromixing <ol><li> micromixing과 RT 반응을 수행하기 전에, RT 반응의 원하는 온도로 micromixer를 평형. <ol><li> 37 내부 micromixer를 놓고 ° C (또는 RT 공급 업체에서 권장하는 온도) RT 반응의 시작하기 전에 적어도 1 시간 보육. </li></ol></li><li> 반대 transcriptase 공급자에 따라 RT 믹스를 설정 (Promega, Qiagen에서 Omniscript에서 예 MMTV - RT) 방법 대신 NG - μg의 총 RNA 입력 (예 : 0.1-1pg/μl)의 사용 단일 셀 금액 제외 금액은 공급 업체에 의해 권장합니다. <ol><li> 우리는 표준 살균, nuclease없는 200μL 얇은 벽의 PCR 튜브를 사용합니다. </li></ol></li><li> 그들은 혼합 준비 마자 안전 micromixer에 위치 RT 튜브. micromixer은 RT 반응의 기간 동안 37 ° C 배양기 안에서 유지됩니다. </li><li> 적절한 빈도와 micromixing의 진폭을 선택합니다. 이 예제에서 우리는 150Hz 사용합니다. </li><li> 에 micromixer 스위치 및 RT 반응 (60 분)의 전체 기간 동안 그것을 두십시오. </li><li> micromixer 끄고 RT 반응이 완료되면 RT 튜브를 꺼내. </li><li> 얼음 RT 튜브를 삽입 및 정량 중합 효소의 연쇄 반응 (qPCR 또는 실시간 PCR)과 같은 추가 애플 리케이션을 정상적으로 진행합니다. </li></ol> 2. 대표 결과 : RT 반응의 맥락에서 micromixing의 장점은 다른 혼합 방법이 (예를 들어, 흔들림 vortexing 또는 분쇄) 사용하는 경우에 상대적으로 cDNA 수확량의 증가이다. 이것은 cDNA를 사용 정량 중합 효소의 연쇄 반응 (qPCR 또는 실시간 PCR)의 후속 분석에 따라, 예를 들어 볼 수 있습니다. 그림 2A 바로 전에 RT 보육 (흑백, "분쇄"로 RT 반응의 분쇄와 비교하여 처음 5 분 동안 micromixing의 효과 (파란색, "micromixed5") 또는 전체 60 분 (빨간색, "micromixed60")를 보여줍니다 ). 이 경우에는 앞의 RT 반응의 부피 25μL이고 그것은 총 RNA의 2.5pg이 포함되어 있습니다. cDNA 대표 Nurr - 1 mRNA를 검출하기위한 primers를 사용하여 qPCR의 흔적은 위에 표시된되며, 수단 ± 같은 실험을 3 반복으로 50 %의 최대 형광에 도달 사이클의 수를 전문가, 대리인은 아래 꾸몄다 있습니다. 별표는 통계적으로 중요한 차이 (Tukey 다중 비교와 편도 ANOVA)을 나타냅니다. 앞의 RT 반응의 전체 60 분 micromixing은 분쇄에 비해 상당한 개선을 생산하는 반면 위의 RT 반응의 첫 번째 5 분 micromixing은 분쇄 이상이 아닌 상당한 개선을 생산합니다, 규모있는 것은 약 15 qPCR에 해당되었다 주기, 평균. micromixing의 혜택도 얻을 이후 qPCR 제품의 곡선 분석을 용해에서 볼 수 있습니다. 유일한 일관성 qPCR을 생산 처음 5 분 또는 분쇄를위한 micromixing 반면에 이전 RT 반응의 전체 60 분 micromixing 그림 2B에 설명된 실험, 중복 표본의 일관성 qPCR 신호 (그림 2Ba, 2 빨간 흔적) 결과 흔적 (그림 2Ba, 2 블루 흔적 2 검은 흔적, 각각). 회색 흔적은 qPCR 반응 밖으로 버려졌습니다 cDNA있는 부정적인 컨트롤 ( "neg.")입니다. 본 실험에서 qPCR 제품은 확실했다 그들의 온도 (즉, 용해 곡선 분석)을 올렸에 의해 변성되었을 때 그 적절한 PCR 제품 (즉, mRNA의보다 높은 농도는 반대로 qPCR에 의해 베꼈는데 및 증폭했을 때 얻은 동일했습니다 amplicon, 표시되지 데이터) 60 분 (그림 2Bb, 2 붉은 자취)에 대한 micromixed했다만이 다음과 같은 RT 반응을 제시했다. 모든 다른 (즉 micromixed5, 분쇄 및 부정적인 컨트롤)은 대체 amplicon 제품 (예 : 뇌관의 dimers) 생성. <img src="/files/ftp_upload/3144/3144fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 표준 실험실 RT 반응에 micromixing를 적용하기위한 프로토콜의 흐름 다이어그램. 물리적인 원리 참여, micromixer 및 내부 micromixer 구축에 더 자세한 설명은 참고 문헌 13,14에서 제공하는 <img src="/files/ftp_upload/3144/3144fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 달리 표준 실험실 RT 반응에서 mRNA의 단일 셀 수량 구성된 RT 반응 앞에 적용 micromixing의 장점을 보여주는 대표 qPCR 데이터입니다. Nurr - 1 유전자를 인코딩 cDNA 나타내는 mRNA를 검출 qPCR 추적 예. 이전 RT 반응이 25μL의 볼륨 총 RNA의 2.5pg 포함되어 ° C 60 분 37 인큐베이터에서 수행되었다. RT 반응은 R의 분쇄에 의해 혼합되었다T는 이전 (빨간색 흔적, "micromixed60"RT 반응 (푸른 흔적 "micromixed5")의 처음 5 분 동안 micromixed 또는 RT 반응의 전체 60 분 micromixed 부화 (검은 흔적, "분쇄")에 혼합 ). 수단 ± 50 % 최대 형광에 도달하는 데 필요한 qPCR 사이클의 수를 전문가, 대리인은 N은 아래 꾸몄다있는이 실험 = 3 반복합니다. 별표 상당한 차이 (Tukey 다중 비교와 단방향 ANOVA)을 나타냅니다. B 다른 qPCR 실험이 25μL의 볼륨 총 RNA의 25pg를 포함하는 RT 반응에 따라 이번 Nurr - 1 cDNA 제품을 검토. qPCR의 흔적 (A)뿐만 아니라 얻은 qPCR 제품의 곡선 분석을 용해가 (B) 다른 혼합 조건 표시됩니다. 아무 cDNA가 이전 RT 반응에 포함되지 않은있는 부정적인 컨트롤도 (회색 흔적 "neg.") 포함되어 있습니다. mRNA의보다 높은 농도로 RT 반응도 수행 및 (b) micromixed60에 대한 (붉은 흔적) 샘플 사람들에게 동일한 용해 곡선 봉우리를 (데이터가 표시되지 않음) 생산되었다.

<ol><li>Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+Funct+Genomic+Proteomic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Brief Funct Genomic Proteomic.</a> 2 (1), 31-31 (2003).</li>
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저자는 공개 없어요.

표준 실험실 RT 반응에 micromixing의 신청 방법은 물론, 참여 할 수 여기에 설명된 모든 방법 (예 : 세포 용해, 레이저 캡처 microdissection)을 통해 수확 mRNA. 그것은 또한 모든 브랜드 또는 형식 RT 시약의 어떤 온도 (micromixer의 재료의 허용 오차 이내), 시간의 기간을 구성하실 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 무작위로 hexamer 또는 oligo - DT primers로 구성된 RT 반응에서 개선 cDNA 수율을 관찰했습니다. 그것은 다음과 같은 제약 조건에 부합하는 다른 생화 학적 변환 (예 : DNA의 하이브리드화 15) 또한 적용될 수 있습니다. 현재 기술의 주요 제약 조건은 반응 곡선 액체 공기 인터페이스 (예 : 초승달 모양) 양식 솔루션의 작은 (microliter) 드롭 내에서 발생해야합니다. 우리는 일상적으로 각각 4.7 또는 6.9mm의 곡률 반지름과 menisci를 생산, 200μL 얇은 벽의 PCR 튜브에 10 25μL의 볼륨을 사용합니다...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 총 RNA는 스냅 언 심하게 준비 성인 마우스 midbrain의 조각으로부터 격리되었다 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PicoPure RNA 격리 키트 </td><td> 아크 투 르스, CA, 미국 </td><td> KIT0204 </td><td> 키트는 현재 응용 Biosystems에서 구할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> DNA - 무료 DNase 처리 및 제거 시약 </td><td> 앰비온 </td><td> AM1906M </td><td></td></tr><tr><td> 랜덤 hexamer primers </td><td> Promega </td><td> C1181 </td><td></td></tr><tr><td> AMV - RT </td><td> Promega </td><td> M5101 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP 세트 </td><td> Promega </td><td> U1240 </td><td></td></tr><tr><td> RNasin Ribonuclease 억제제 </td><td> Promega </td><td> N2111 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease - 프리 워터 </td><td> Promega </td><td> P1193 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR 그린 PCR 마스터 믹스 </td><td> 응용 Biosystem </td><td> 4,309,155 </td><td></td></tr><tr><td> Hprt 전달 (20mer) : CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hprt 반대 (20mer) : 문신 GTC CCC CGT TGA CTG AT </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nurr1 전달 (23mer) : 편대의 편대 장 CTC CGA CTT TTT AAC TCC AG </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nurr1 반대 (23mer) : GGT 개그 GTC CAT GCT AAA CTT GA </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1,000 분광을 NanoDrop. </td><td> 써모 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 코벳 로터 진 RG - 6000 </td><td> 코벳 생명 과학 </td><td></td><td> 코벳 생명 과학 2008 년 7 월 QIAGEN에 의해​​ 인수되었다 </td></tr></tbody></table>

어쿠스틱 microstreaming를 사용하여 표준 실험실 역방향 transcriptase 반응에서 mrna의 단일 세포로부터 cdna 수량 산출 증가

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

세포의 행동과 연관 유전자 발현은 이상적으로 단일 세포 수준에서 이루어집니다. 그것이 베꼈는데를 반대하기 전에 하나의 셀 (1월 1일에서 5일까지 - 50pg 총 RNA의 % 또는 0.01 - 2.5pg mRNA, 셀 하나 당)에있는 불안 정한 mRNA의 작은 금액은 대부분이 저하하기 때문에 그러나, 이것은 쉽게 달성되지 않습니다 안정적인 cDNA 사본으로. 예를 들어, 표준 실험실 시약 및 하드웨어를 사용하여, 유전자의 단지 소수가 질적으로 전지 2마다 평가하실 수 있습니다. mRNA의 단일 셀 금액 구성된 표준 실험실 반전 transcriptase (RT) 반응 (microliter 볼륨에서 즉, 표준 시약)의 효율성을 높이는 한 가지 방법은 그것이 저하되기 전에 mRNA가 cDNA로 변환 수 있도록보다 신속하게 시약을 혼합하는 것입니다. 그러나 microliter 비늘에서 액체 흐름이 층류이기 때문에 이것은 하찮은되지 않습니다, 즉 혼합의 현재 방법 (흔들림 vortexing 및 분쇄 즉)은 효과적으로 시약을 혼합하는 데 충분한 혼란 움직임을 생산하기 위해 실패합니다. 이 문제를 해결하기 위해서, 마이크로 스케일 혼합 기법 3,4을 사용해야합니다. microfluidic 기반의 혼합 기술의 숫자가 성공적으로 RT 반응 수율에게 5-8를 증가하는 개발되었습니다. 그러나, microfluidics 기술은 상대적으로 비싸고 아직 널리 사용할 수없는 전문적인 하드웨어가 필요합니다. 저렴, 더 편리한 솔루션은 바람직합니다. 본 연구의 주요 목적은 mRNA의 단일 셀 수량 구성된 표준 실험실 RT 반응에 소설 &quot;micromixing&quot;기술의 응용은 크게 자신의 cDNA 수확량을 증가하는 방법을 보여줍니다하는 것입니다. 우리는 cDNA 산출이 가능하게 약 10 - 100 - 배로 증가 발견 (1) 세포마다 분석하는 유전자의 큰 숫자, 유전자 발현 (2) 더 많은 정량 분석​​하고, 낮은 풍부한 유전자 (3) 좋은 검출 단일 세포 인치 micromixing는 음향은 9-12 작은 장애물 주위에 전파 음파가 장애물 근처에 의미 흐름을 만드는 현상을 microstreaming을 기반으로합니다. 우리는 주요 단순화와 음향 microstreaming 기반 장치 (이하 &quot;micromixer&quot;) 개발, 음향 microstreaming는 시스템이 굴곡 13 작은 반경을 가진 액체 공기 인터페이스를함으로써 오디오 주파수에서 얻을 수 있습니다. 튜브 솔루션 microliter 볼륨의 초승달 모양은 곡률 적절하게 작은 반경을 제공합니다. 오디오 주파수의 사용은 하드웨어가 저렴 13 다용도 수있다는 것을 의미하고 표준 연구소 sonicators 함께 할 수처럼 핵산 및 다른 생화 학적 시약이 손상되지 않습니다.

우리는 달리 일반 실험실 역방향 전사 반응에서 mRNA의 단일 셀 수량로부터 cDNA 수율을 높이기 위해 새로운 방법을 설명합니다. 참신은 흔들림 vortexing 또는 분쇄보다 효과적으로 microliter 비늘에서 유체를 섞어, 음향 microstreaming의 현상을 활용 micromixer의 사용에 있습니다.

어쿠스틱 Microstreaming를 사용하여 표준 실험실 역방향 Transcriptase 반응에서 mRNA의 단일 세포로부터 cDNA 수량 산출 증가

유전자 발현과 세포 행동의 상관관계를 분석하는 것은 단일 세포 수준에서 수행하는 것이 가장 이상적입니다. 하지만 소량의 ...로 인해 이는 쉽게 달성되지 않습니다.

이 절차는 단일 세포 수준의 mRNA 양으로부터 CD NA 수율을 높이는 방법입니다. 먼저 역전사 반응에 필요한 온도로 설정된 인큐베이터 내부에서 마이크로 믹서를 평형화하십시오. 그런 다음, 마이크로리터 부피의 단일 세포 RNA 양을 포함하는 표준 실험실 RT 반응을 준비하십시오.반응 튜브를 혼합 홀에 안정적으로 배치하고, 적절한 혼합 파라미터를 선택한 후 마이크롬 믹서(microm mixer)의 전원을 켭니다. 궁극적으로, 이 절차는 RT 반응을 위한 준비 단계로서 정량 PCR을 통해 cDNA 수율을 높이는 데 사용될 수 있습니다. 마이크롬 믹서를 37 °C 인큐베이터에서 최소 1시간 동안 평형화하십시오.표준 멸균 누클레아제 프리 200 µL 박벽 PCR 튜브를 사용합니다. 공급업체의 지침에 따라 역전사 반응을 준비하되, 투입되는 총 RNA 양은 단일 세포 수준으로 사용하십시오. 이제 마이크로 믹싱의 적절한 주파수와 진폭을 선택합니다.다음으로 튜브를 마이크로 믹서에 단단히 고정합니다. 그런 다음 마이크로 믹서를 켭니다. 반응이 60분 동안 진행되도록 둡니다. 완료되면 마이크로 믹서의 전원을 끄고, 이후의 다운스트림 애플리케이션에 즉시 사용할 수 있도록 반응물을 얼음에 옮깁니다. 다른 방법들과 비교했을 때, RT 반응 맥락에서 마이크로 믹싱의 주된 장점은 cDNA 수율입니다.본 정량적 중합효소 연쇄 반응 분석에서, neuro one mRNA를 나타내는 cDNA를 검출하도록 설계된 프라이머를 사용한 QPCR 트레이스는 RT 반응 직전의 배양 시간과 비교하여 처음 5분 또는 60분 전체 동안 microm 믹싱을 수행했을 때의 효과를 보여줍니다. 처음 5분 동안의 microm 믹싱은 유의미한 개선을 가져오지 않았습니다. 그러나 60분 전체 동안 microm 믹싱을 수행한 결과, 15 QPCR 사이클에 해당하는 유의미한 수율 향상이 나타났습니다.또한, QPCR의 융해 곡선 분석 결과, 앞선 R two 반응의 전체 60분 동안 마이크로 믹싱을 수행한 경우 빨간색 추적선에서 보는 바와 같이 중복 시료에서 일관된 신호가 생성됨을 보여줍니다. 이는 파란색으로 표시된 초기 5분 동안의 마이크로 믹싱이나 검은색으로 표시된 단순 교반 시 관찰된 가변적인 추적선과 대조적이며, 회색 추적선은 템플릿 대조군(no template controls)입니다.

increasing-cdna-yields-from-single-cell-quantities-mrna-standard

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